基于LF-NMR和3D-SFS的植物糖浆掺假蜂蜜快速鉴别技术

李旺旺，李琳琳，梁斌，汪旭海，李恒明，龙门*

1. 生物与食品工程学院滁州学院（滁州 239000）；2. 安徽泓顺源生物科技有限公司（滁州 239000）

市场上蜂蜜种类繁多，但消费者对蜂蜜产品的辨识度不够，许多不法分子为牟取暴利，通过掺杂使假等手段制作假蜂蜜[1]。蜂蜜是以果糖和葡萄糖为主的多糖类物质，其含量占蜂蜜的70%～80%[2]，因此在蜂蜜中混入类似的糖类物质是常见的掺假手段。最初是在蜂蜜中掺入白糖水[3]，但此种掺假手段易被感官技术和理化检测辨别出来，现在最常见的是在蜂蜜中掺入高果糖浆、淀粉糖浆等[4]。掺入糖浆的蜂蜜成分虽然与天然蜂蜜成分类似，但其营养价值截然不同，且消费者食用后，造成血糖升高可引发糖尿病、体重增加、血脂水平增加等[5]。我国国家标准规定，不得在蜂蜜中添加或混入任何淀粉类、糖类或代糖类物质[6]。

现阶段，常采用感官检验法[7]、花粉分析法[8]和理化指标测试法[9-11]进行蜂蜜品质分析。其中：感官检验法需要检测人员拥有丰富的经验，且存在一定主观性；花粉分析法虽操作简单、耗时短、成本低，受外界环境影响大，存在较大不确定性，只能作为判断蜂蜜真伪的初筛手段；理化检测耗时长、过程繁琐、人为误差大。近年来，随着仪器分析的发展，有学者使用不同检测技术对蜂蜜品质进行控制，以期规范蜂蜜市场秩序，主要包括液相色谱质谱法[12-14]、气相色谱法[15-16]、电子舌法[17]、稳定同位素技术[18]和光谱法[19-20]，但这些检测方法只在一定范围内适用，并且面对不断提升的造假掺假技术，实际使用中更难以满足市场监管需求。

低场核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技术是利用不同物质的弛豫时间不同，同一物质处于不同相态的弛豫时间也有区别以分辨不同物质，是一种无损、快速的检测方法，被广泛应用于食品安全检测领域[21]。彭丹等[22]采用低场核磁共振技术结合化学计量学，分别利用聚类分析和支持向量机对花生油掺入大豆油（玉米油）进行鉴别，结果表明支持向量机相比于聚类分析可更好地实现对花生油真伪的鉴别，该模型对掺伪花生油的正确识别率为100%；张美军[23]通过低场核磁共振技术对不同产区五味子进行自旋回波衰减信号（carr purcell meiboom gill sequence，CPMG）分析，结合最小二乘回归法交叉验证确定建立五味子样品合适的水分与挥发油含量预测模型，从而实现五味子不同产地来源的区分；盖圣美等[24]利用低场核磁共振及磁共振成像技术实现对注水肉糜的快速鉴别。

荧光光谱分析技术的原理是利用样品中荧光物质产生荧光效应，这些荧光物质可以是源自于食品样品内部，即由样品自身成分产生荧光效应，被称为内源性荧光物质（autofluorescence）[25]。蜂蜜含有大量的荧光团，如多酚、少量蛋白质、肽、氨基酸（色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）[26-27]。这些荧光物质可以在一定的激发波长范围内发出荧光。因此，荧光光谱法适用于鉴定蜂蜜的真实性。试验以纯油菜蜜为研究对象，利用LF-NMR技术和三维同步荧光技术（threedimensional total synchronous fluorescence spectroscopy，3D-SFS）结合化学计量学方法对掺假比例0～100%的油菜蜜进行检测，通过神经网络建立蜂蜜掺假判别模型，实现对糖浆掺假油菜蜜的有效识别，为蜂蜜的鉴别和质量监控提供参考方法。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

纯油菜蜜（产地分别为江苏、内蒙古呼伦贝尔市海拉尔区安徽、四川，安徽泓顺源生物科技有限公司）；麦芽糖浆80B、果葡糖浆F60、全蔗糖糖浆（广西梧州乐哈哈食品工业有限公司）；3D-SFS检测时使用1 cm×1 cm石英比色皿。

1.2 主要仪器与设备

MesoMR23-060V-I核磁共振分析仪（上海纽迈电子科技有限公司）；Cary Eclipse型荧光分光光度计（美国安捷伦科技公司）；PL203型电子天平（英国梅特勒-托利多仪器有限公司）；HHS-11-4电热恒温水浴锅（常州恒隆仪器有限公司）；HYQ-3111涡旋混匀器（上海珂淮仪器有限公司）；DHG-9101-OSA型电热恒温鼓风干燥箱（江苏盛蓝仪器制造有限公司）。

1.3 试验条件

1.3.1 样品制备

将3种糖浆与4个产地油菜蜜按照不同比例进行混合设置试验组。糖浆与蜂蜜的总质量固定为10 g，掺假比例按照0～100%进行设置，糖浆增量5%，共设置21个梯度；称取目标梯度的蜂蜜，按照掺假比例再称取对应质量的糖浆混合，使用涡旋混匀器以300 r/min转速混匀1 min，使糖浆与蜂蜜充分混合，置于45 ℃恒温水浴锅中45 min去除水泡，形成由3个纯植物糖浆样品、4个纯蜂蜜样品、19×12个掺假蜂蜜样品组成的235个样品，形成样品组。

1.3.2 蜂蜜水分检测

将称量瓶洗净烘干，称量其质量，记为m1，往称量瓶中加入5 g海砂，将其置于105 ℃恒温干燥箱中干燥1 h，取出后将其置于放有有效干燥剂的干燥器内冷却0.5 h，称量其质量，重复干燥及冷却操作直至称量结果恒重（前后2次质量差不超过0.000 2 g）。向称量好海砂的称量瓶中称取2 g（称量结果精确至0.000 1g）样品，记为m2。轻微摇动称量瓶使样品与海砂充分混匀。混匀后置于沸水浴上蒸干。蒸干后置于105℃恒温干燥箱中4 h。取出后置于放有有效干燥剂的干燥器中冷却0.5 h，取出后对其质量进行称量，称量完成后置于恒温干燥箱中干燥1 h，干燥结束后取出，置于干燥器中冷却0.5 h，对其质量再次进行称量，若前后称量结果不超过0.000 2 g则达到恒重，若未能达到恒重，则重复干燥及冷却操作直至其达到恒重，最后一次的称量结果记为m3。样品水分按式（1）计算。

式中：M为样品水分，g/100 g；m1为称量瓶质量，g；m2为称量瓶（含海砂）质量与样品干燥前质量，g；m3为称量瓶（含海砂）质量与样品干燥后质量，g。

1.3.3 LF-NMR检测

样品的预处理：将235个掺假蜂蜜样品从冰箱中取出，置于45 ℃恒温水浴锅中恒温加热45 min。

核磁共振分析仪的参数设置：序列设置为QCPMG，谱宽（SW）100，中心频率416 796.321 Hz，测试温度32 ℃，脉冲宽度（p1）11 μs，延迟时间（d1）1 s，扫描次数（ns）8。

1.3.4 3D-SFS检测

扫描模式设置为同步模式，数据模式为荧光，激发波长200 nm，起始波长250 nm，终止波长850 nm，激发狭缝5 nm，发射狭缝5 nm，激发终止波长750nm，激发波长增量5 nm，扫描速度中等。

2 结果与分析

2.1 糖浆掺入比例与蜂蜜水分的关系

由图1～图3可以看出：四川、海拉尔与安徽3个产地油菜蜜掺假样品的水分与蔗糖糖浆的掺入比例存在明显线性关系，3个产地的油菜蜜掺假样品的水分均随着蔗糖糖浆掺入比例的增加而增加，而江苏产地的油菜蜜掺假样品与蔗糖糖浆的掺入比例并不存在明显线性关系；掺入麦芽糖浆的油菜蜜样品的水分与掺入比例均存在明显线性关系，4个产地油菜蜜掺假样品的水分随着麦芽糖浆掺入比例的提高而下降，同时表明麦芽糖浆导致的这种趋势走向与油菜蜜的来源地之间无明显关系；四川与海拉尔2个产地油菜蜜的水分与掺入果葡糖浆的比例无线性关系，而江苏与安徽产地油菜蜜的水分与掺入果葡糖浆的比例表现出弱正相关关系，随着果葡糖浆掺入比例的提高，这2个产地油菜蜜掺假样品的水分增加，说明果葡糖浆的掺入量是影响江苏与安徽2个产地油菜蜜水分的因素但不是主要影响因素。

图1 4个产地油菜蜜的水分与蔗糖糖浆比例的线性关系图

图2 4个产地油菜蜜的水分与麦芽糖浆比例的线性关系图

图3 4个产地油菜蜜的水分与果葡糖浆比例的线性关系图

2.2 LF-NMR采集的样品数据分析

采用Levenberg-Marquardt，选取160个掺假蜂蜜样品作为训练集，34个掺假蜂蜜样品作为验证集，34个掺假蜂蜜样品作为测试集，隐含神经元数量默认为10，经训练得到图4。训练集、验证集、测试集及综合集的R值分别为0.799 24，0.367 57，0.396 236与0.691 8，R值越接近1说明拟合程度越好，从综合训练结果图来看，训练集、验证集、测试集与综合集的数据的拟合效果都差强人意，因此此模型不适合用作判别掺入植物糖浆的蜂蜜。

图4 核磁共振测数据所做的蜂蜜掺假判别模型图

2.3 3D-SFS样品数据分析

2.3.1 特征发射波长差Δλ的选取

通过对3种纯糖浆、4个产地纯蜂蜜与4个产地掺入3种糖浆50%比例的蜂蜜的三维同步荧光图发现，发射波长差Δλ=80 nm时，其荧光强度变化差异最大。根据图5可以发现，在激发波长Ex=250～450 nm附近的荧光强度（R.U）变化差异非常明显，说明样品中荧光物质的差异在此处最为明显。

图5 发射波长差Δλ=80 nm时安徽、江苏、海拉尔与四川4种产地的油菜蜜与麦芽、蔗糖与果葡3种糖浆的荧光强度变化图

2.3.2 主成分分析

根据选取的特征发射波长Δλ=80 nm对3种纯糖浆与4种纯蜂蜜样品的三维同步荧光数据在此波长时的数据进行主成分分析，得到图6，提取的第一主成分、第二主成分与第三主成分对数据的信息描述分别为75.67%，19.72%与4.13%，三者累加的数据信息表述量为99.52%，说明3个主成分包含原数据的99.52%。蜂蜜与糖浆之间可以明显区分开，4种蜂蜜聚集在一起而3种糖浆则分散开，说明所选择的发射波长差Δλ=80 nm可作为用于判别掺入植物糖浆的蜂蜜的特征发射波长。

图6 3种纯糖浆与4种纯蜂蜜样品的三维同步荧光主成分分析图

2.3.3 利用神经网络建立蜂蜜掺假判别模型

数据的训练算法采用Levenberg-Marquardt，选取160个掺假蜂蜜样品作为训练集，34个掺假蜂蜜样品作为验证集，34个掺假蜂蜜样品作为测试集，隐含神经元数量默认为10，经训练得到图7。训练集、验证集、测试集及综合集的R值分别为1，0.946 54，0.974 86与0.946 54，R值越接近1说明，拟合程度越好，综合训练结果图来看，训练集、验证集、测试集与综合集对数据的拟合效果较好，因此模型可用作判别掺入植物糖浆的蜂蜜。

图7 三维同步荧光检测数据所做的蜂蜜掺假判别模型图

3 结论

通过建立散点图分析油菜蜜掺假样品与植物糖浆掺入量的关系发现，麦芽糖浆的水分与油菜蜜的水分有着明显差异，且麦芽糖浆在蜂蜜中的掺入量与油菜蜜的水分变化呈现一定的线性关系，且这种线性变化趋势受蜂蜜的来源地影响很小，因此在检测掺入麦芽糖浆的蜂蜜时可将水分作为一个有效的检测指标。掺入蔗糖糖浆的油菜蜜的水分与糖浆掺入量之间的关系受到蜂蜜来源地的影响，无明显线性关系。掺入果葡糖浆油菜蜜的水分与糖浆掺入量之间无线性关系，其水分受其他因素的影响。因此，鉴别掺入植物糖浆的蜂蜜时，水分只能作为参考指标，准确鉴定则需依靠其他有效的鉴别方法。

对蜂蜜和掺假蜂蜜（植物糖浆+油菜蜜）的LFNMR和3D-SFS采集数据进行分析，结合化学计量学探索区植物糖浆掺假蜂蜜可行性。从LF-NMR数据建立的模型拟合结果来看，该模型的适用性不强。从3D-SFS的数据建立的模型拟合结果来看，其在识别掺入植物糖浆蜂蜜时适用性好。掺入植物糖浆后，油菜蜂蜜的荧光物质强度变化有明显规律，在发射波长Δλ=80 nm，激发波长Ex=250～450 nm时，其变化最为明显，通过主成分分析对此特征发射波长差的适用性做了进一步验证，综上所述3D-SFS可简单、快速地用于未知蜂蜜的植物糖浆掺假鉴别，为规范蜂蜜市场提供有利依据。