基于网络药理学探讨“金银花-连翘”药对防治新型冠状病毒肺炎的作用机制∗

刘晴晴，康锦花，龙文杰，宁怡乐，王陵军，杨忠奇△

1 广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405； 2 广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405

新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）传染性强，潜伏期久，人群普遍易感。该病毒是迄今第7 种可感染人类的冠状病毒，其引发的重症病例和病死率较高［1-3］。目前还没有针对由新型冠状病毒（2019 Novel Coronavirus，2019-nCoV）的特效药，而中医药在此次疫情防控中发挥了极大优势并取得了显著疗效［4-5］。银翘散是辛凉解表类的代表性方剂，用于治疗温病初起卫分证及风热表证，已在临床上广泛应用于防治COVID-19，国家卫健委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第三版）》将其纳入COVID-19 治疗方案中［6］。现代药理研究表明，该方具有显著抗病毒、抗炎、抗菌、抗过敏、解热及增加免疫力的作用［7］，临床上主要用该方治疗流行性感冒、腮腺炎、咽结膜炎、咽峡疱疹、麻疹、单纯疱疹性角膜炎、病毒性心肌炎等病毒感染性疾病［7］。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）》［8］中医诊疗方案中，医学观察期（指疑似病例或居家自我隔离病人）有乏力伴发热的疑似病例推荐服用中成药有金花清感颗粒、连花清瘟胶囊（颗粒）、疏风解毒胶囊（颗粒）等，上述药中“金银花-连翘”均为其主要成分，故金银花、连翘在治疗COVID-19 中发挥着重要作用。本实验旨在采用网络药理学的研究方法，收集“金银花-连翘”（简称“银翘”）药对所含成分与COVID-19 相关炎症靶点，构建“中药-活性成分-靶点”相互作用网络，筛选关键作用靶点和活性成分群，为中医药治疗新冠肺炎提供一定的理论基础与科学依据。

1 材料与方法

1.1 药物活性成分及靶点检索及筛选 中药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）提供中药成分数据及靶标、疾病信息。口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和类药性（drug-likeness，DL）是进行中药化合物筛选的关键指标。本研究借助TCMSP 数据库检索“金银花”“连翘”，以OB≥30%和DL≥0.18［9］进行有效成分及相应靶标的查询与筛选，在Unitprot 数据库（http：//www.Uniprot.org/）查询靶标蛋白的基因名字，获取“银翘”药对相关靶点基因。

1.2 COVlD-19 相关靶点获取GeneCards 数据库（http：//www.genecards.org/）是一个整合了约150 个网络来源的以基因为中心的综合性在线数据库，包括基因组、转录组学、蛋白质组学、遗传、临床和功能信息，提供所有有关注释和预测人类基因的全面信息。本研究在GeneCards 数据库中检索“Novel coronavirus pneumonia”，得到与人类COVID-19相关的基因，作为COVID-19的候选靶点基因。

1.3 “药物活性成分‐作用靶点-疾病” 网络构建将获得的“银翘”药对相关靶点与COVID-19靶点基因相映射，进行Venn 作图分析，获得二者交集靶点基因，然后使用Cytoscape 3.7.2 软件进行“药物活性成分‐作用靶点-疾病”网络构建，根据化合物与靶点连接情况筛选出“银翘”药对作用于COVID-19的关键化合物。

1.4 靶蛋白相互作用网络的构建及关键靶点筛选为了研究“银翘”药对治疗COVID-19 的靶蛋白之间的相互作用，将药物‐疾病交集靶点基因通过相互作用数据库平台STRING（http：//stringdb.org/）进行相互作用蛋白查询并构建蛋白相互作用网络（protein-protein interaction，PPI），物种设置为“人”（homo sapiens），最低相互作用评分设置为最高等置信度“highest confidence（0.400）”，其余参数保持默认设置，得到“银翘”药对防治COVID-19 的体内反应网络。然后使用Cytoscape 3.7.2 软件对PPI 网络进行拓扑分析，筛选出PPI网络中关键靶蛋白。

1.5 基因本体论(gene ontology,GO)分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and gnomes,KEGG)通路富集分析GO分析主要用于注释基因的功能，包括细胞组分、分子功能和生物过程，已被广泛应用于生物基因功能分类。利用生物学信息注释数据库DAVID 6.8，以人类为研究对象，对“银翘”药对治疗COVID-19的靶基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，以研究“银翘”药对治疗COVID-19 靶点的主要生物学过程和代谢通路。以P＜0.01 进行靶基因筛选，得到“金银花-连翘”靶点主要的生物过程和药理作用机制中可能性较大的通路，并进一步筛选与COVID-19 相关的信号通路，探讨“银翘”药对治疗COVID-19的生物学过程及信号通路。

2 结果

2.1 “银翘”药对有效成分及靶点筛选结果利用TCMSP筛选出金银花已知成分266种，连翘已知成分150 种，通过OB≥30%和DL≥0.18 条件进行筛选，获得金银花、连翘各23 个符合条件的有效成分，见表1。46个有效成分对应204个相关靶点。

表1 “银翘”药对的有效活性成分

2.2 COVlD-19 相关靶点获取结果在Gene-Cards 数据库里检索“Novel coronavirus pneumonia（新型冠状病毒肺炎）”，获得COVID-19相关基因259个。

2.3 “中药化合物-靶点-疾病”的网络构建及可视化分析将204 个中药化合物靶点与259 个COVID-19 靶点基因进行Venn 分析，借助Cytoscape 3.7.2 软件进行蛋白网络结构可视化处理，构建“中药化合物‐靶点-疾病”网络图，见图1。如图1 所示，获得药物‐疾病交集基因44 个，对应“银翘”药对有效化合物26个（26个有效成分均参与网络构建）。在26 个有效化合物中有Quercetin （檞皮素）、luteolin（木犀草素）、Wogonin（汉黄芩素）、kaempferol（山柰酚）、betasitosterol（β-谷甾醇）、beta-carotene （β-胡萝卜素）、Chryseriol（金圣草黄素）、FORSYTHINOL（连翘苷）、（-）-Phillygenin （连翘脂素）、hyperforin（金丝桃素）、（+）-pinoresinol monomethyl ether（松脂素单甲基醚）等，其中以檞皮素、木犀草素、汉黄芩素、山柰酚、β-谷甾醇为多。见图2。

图1 “银翘”药对有效成分靶点和COVID-19相关靶点关系的Venn图

图2 “化合物-靶点-疾病”可视化网络图

2.4 靶蛋白相互作用PPl 网络分析将44 个药物-疾病交集靶点通过STRING 数据库进行蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI） 网络分析，PPI 网络中有44 个相互作用节点，214 条相互作用连线。根据Count 值筛选列举出“银翘”药治疗COVID-19排名前30的关键靶点蛋白，见图1，见图3—4。

图3 “银翘”药对防治COVID-19相关靶点的PPI网络

图4 “银翘”药对防治COVID-19的关键靶点

2.5 GO 功能分析借助DAVID 6.8 数据库，对“银翘”药防治COVID-19 的44 个靶基因进行GO 富集分析，44个药物‐疾病交集基因影响了79个生物功能（以P＜0.01为筛选标准）。在79条功能分析条目中，涉及到受体配体活性、转录因子活性、细胞因子活性、趋化因子活性、酶活性及生物合成过程的调控等各方面，选取排名前20 位的靶基因功能信息，见图5，主要富集在细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性、趋化因子受体结合、蛋白磷酸酶结合、生长因子受体结合、G 蛋白偶联受体结合、泛素样蛋白连接酶结合等方面。

图5 GO 富集分析柱状图

2.6 KEGG通路富集分析富集通路发现44 个交集靶点显著富集在146 条通路上（P＜0.01），包括炎症、免疫、激素代谢、凋亡、自噬等方面。选取前20 条目，结果显示，“银翘”药物主要影响的通路有：糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、IL-17信号通路、TNF 信号通路、Toll 样受体信号通路、C型凝集素受体信号通路、HIF-1 信号通路、NF-κB信号通路、NOD 样受体信号通路等经典信号通路。此外还与多种传染性疾病相关，如甲型流感、丙肝、百日咳、结核、巨细胞病毒感染、EB 病毒感染等相关。见图6。

图6 KEGG通路富集

3 讨论

许多医学家认为热毒疫邪是此次新型冠状病毒肺炎的主要病因，用温病学理论指导临床治疗也取得良好效果。“银翘”药对即“金银花-连翘”是治疗温病最常用的药对之一，二者常常相须为用以增强清热解毒、疏风散热之功效。金银花为忍冬科忍冬属植物的干燥花蕾，其性甘、寒，气味芳香，具有清热解毒、疏散风热的功效，多用于风热感冒、温病发热、热毒血痢、喉痹等各种细菌病毒感染，有“中药青霉素”之称。连翘为木犀科植物连翘的干燥果实，可清热解毒、消肿散结、疏散风热，用于治疗风热感冒、温病初起、温热入营、高热烦渴、丹毒等。其性甘寒，可清上半身之热的金银花配以性苦微寒擅于透达全身之热的连翘，可在解卫分之热毒的同时，祛除温热病邪常伴随的秽浊之气。清代温病学者吴鞠通擅用金银花、连翘，其所著《温病条辨》载方剂204 首，其中金银花、连翘药对出现的方剂达26 方，有名的代表方剂为银翘散［10］。

本研究显示，“银翘”药对中有效化合物为46个，对应的有效成分作用靶点204 个，其中与COVID-19相关共同作用靶点44个。PPI结果显示其 防 治COVID-19 的 关 键 靶 点 为IL-6、IL-1β、MAPK1、MAPK8、CXCL8、RELA、CCL2、IL-10、ICAM1、IL-2、PTGS2、CASP3、MAPK14、STAT1、EGFR、FOS、IL-4等，这些关键靶点涉及细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性、趋化因子受体结合、蛋白磷酸酶结合、生长因子受体结合、G 蛋白偶联受体结合、泛素样蛋白连接酶结合等生物学过程。其中“银翘”药防治COVID-19 主要有效成分为Quercetin（檞 皮 素）、luteolin（木 犀 草 素）、Wogonin（汉黄芩素）、kaempferol（山柰酚）、betacarotene（β-胡萝卜素）、Chryseriol（金圣草黄素）、FORSYTHINOL（连翘苷）、（-）-Phillygenin（连翘脂素）、hyperforin（金丝桃素）、（+）-pinoresinol monomethyl ether（松脂素单甲基醚）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）等，其中以檞皮素、木犀草素、汉黄芩素、山柰酚为主。研究表明［11］，檞皮素可通过调控TLR4/NF-κB 通路或JAK2/STAT3信号通路，减轻炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6等的分泌以减轻肺脏炎症反应。邓东沅等［12-13］研究表明，木犀草素能调控TLR 通路和凋亡相关因子Caspase-3、Caspase-8 的表达，减轻流感病毒对宿主细胞的免疫损伤，发挥抗病毒作用。汉黄芩素可通过减少巨噬细胞ROS的产生，抑制NF-κB调控的炎症因子，从而抑制巨噬细胞炎症反应，亦能抑制流感病毒感染后巨噬细胞内各种炎症相关因子的产生［14-15］。山柰酚通过阻止NF-κB的活化，从而在mRNA 水平及蛋白水平抑制iNOS、COX-2 及CRP，达到抗炎的目的［16］。山柰酚能有效抑制HepG2 细胞增殖，且在一定的浓度范围内呈浓度依赖性，山柰酚可以通过抑制自噬诱导HepG2 细胞凋亡。有学者发现，连翘脂素能够通过诱导TGF-β释放和IL-10 受体表达来干预巨噬细胞的抗炎功能［17］。LIU 等［18］发现连翘脂素可通过抑制Akt 磷酸化来减少呼吸疾病中炎症反应并影响葡萄糖代谢。研究表明［19］，连翘苷可通过调控JAK/STAT、PI3K/Akt 通路减轻流感病毒感染的小鼠肺部炎症细胞的浸润，降低肺部流感病毒的滴度。

经KEGG 通路分析，“银翘”药对防治COVID-19的通路有146 条，主要涉及炎症、免疫、激素代谢、凋亡、自噬等方面。与COVID-19 紧密相关的通路分别为参与糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路、C 型凝集素受体信号通路、HIF-1 信号通路、NF-κB 信号通路、NOD 样受体信号通路、T 细胞受体信号通路、JAK-STAT 信号通路、VEGF 信号通路、MAPK 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、p53 信号通路、FOXO 信号通路等经典信号通路。此外，“银翘”药对还与细胞凋亡、自噬以及多种细菌或病毒感染相关，如对甲型流感、丙肝、百日咳、结核、麻疹病毒、巨细胞病毒、EB 病毒感染等通路进行调控。IL-17 主要有促进炎症反应的功效，它参与了多种先天性和适应性的免疫应答。DING 等［20］的研究发现，阻断IL-17 信号通路可以显著降低脓毒症诱导的急性肺损伤所致的肺部炎症反应。HIF-1α是低氧条件下重要的转录因子，它可以调节VEGF的转录和表达，调控并参与局部组织血管新生的过程。哮喘发作期肺部组织缺氧时，血管平滑肌细胞通过自身细胞的大量增殖并释放HIF-1α，增强VEGF 的转录及蛋白表达，促进局部组织血管新生［21-22］。C型凝集素受体（C-type lectin receptor，CLR）信号通路在天然免疫和继发免疫中发挥重要作用，尤其是病原微生物的识别与信号传导、抗原呈递、介导免疫细胞间相互作用等。研究表明，类属跨膜蛋白的CLR 通过激活吞噬细胞中的炎症和抗菌反应直接识别微生物细胞壁并影响先天免疫，对巨噬细胞，树突状细胞和嗜中性粒细胞等细胞吞噬作用的激活和调节有重要贡献［23］。NF-κB的活化可诱导多种促炎因子、趋化因子和抗凋亡蛋白的表达，结核分枝杆菌Hsp70依赖NF-κB信号通路诱导树突状细胞表达TNF-α、IL-12p40和IL-6［24］。MAUAD 等［25］通过对H1N1 流感死亡患者肺部组织的病理研究发现死者肺内的TLR3、TNF-α 和IFN-γ 的表达显著上调，这说明Toll 样受体信号通路在H1N1 流感发生过程中也起着重要的作用。NOD 样受体信号通路在细菌入侵时发挥重要作用，当细菌成分入侵时，NOD 样受体被激活，接着可激活NF-κB通路、MAPK通路，增加促炎因子的释放。也有研究表明感染流感病毒后，细胞因子IL-1β的产生需要TLR 和NLR 的共同作用与相互协调［26］。

综上所述，本研究基于网络药理学的方法，对“银翘”药对防治COVID-19 的作用机制进行了分析，分析发现“银翘”药对是通过多成分、多靶点、多通路来发挥抗病毒、抑菌抗炎、调节免疫作用来防治COVID-19 的作用，为中医药配伍治疗COVID-19 的研究提供了新方法和新思路。本研究不可避免地存在一些缺陷，如网络药理学是基于已有数据库中的相关数据进行研究，数据搜集的全面性及活性成分筛选标准的制定尚不能做到完全准确，这些需要在今后进一步去验证。