基于基因测序技术分析肛瘘患者微小RNA的表达特点及功能

蔡涛 李志 冷羽 张泰魏 曹波 吴雪峰 景茂林 张琪琦 吴媛媛 王雪亮 李欢

肛瘘是肛门直肠部位的常见疾病,多为肛周脓肿发展的延续[1]。近年来随着生活及饮食模式的变化,肛肠疾病的发病率持续上升,肛肠疾病发病率在成年人中达50.1%,我国肛瘘发病率占肛肠病的1.67%～3.60%[2,3]。microRNA(miRNA)是小的内源性非编码 RNA,已被证明可以影响许多重要的生物学过程,如细胞生长、组织分化、细胞增殖、胚胎发育和细胞凋亡。因此,miRNA 功能的失调会导致人类发生疾病[4]。发现miRNA、确定其靶标并进一步推断 miRNA 功能已成为了解 miRNA 的正常生物学过程及其在疾病发展中的作用的关键策略。多项研究表明,包括癌症、心血管和代谢疾病在内的无数生理过程和病理过程均高度依赖于miRNA[5]。然而,对于肛瘘的特征性miRNA及其相关通路的研究报道却十分有限。RNA测序(RNA-Seq)是近年来发展较为成熟的高通量测序技术,具有快捷分析、高分辨率等优势[6]。目前国内外鲜有关于肛瘘患者特征性表达miRNA的报道,既往有课题组通过基因检测技术共得出13个差异表达的miRNA,但该研究存在样本量较小等不足[7]。为得到更加准确的研究结果,本研究纳入6例极具代表性的高位复杂性肛瘘患者,采用RNA-Seq技术筛选出在肛瘘组织中特异性表达的miRNA,进一步丰富肛瘘患者特征性表达miRNA的数据库,旨在为临床中肛瘘的诊断及防治提供一定的证据及思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 病例均来源于贵州中医药大学第一附属医院肛肠科2021年10月至2021年11月符合纳入标准的高位复杂性肛瘘住院手术患者,本研究共计纳入6例极具代表性的患者。所有患者签署知情同意书,并通过医院伦理审查。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准:(1)符合2006 年中华中医药学会肛肠分会,中华医学会外科学分会结直肠肛门外科学组,中国中西医结合学会大肠肛门病专业委员会制定的《肛瘘临床诊治指南》高位复杂性肛瘘诊断;(2)经历≥2次肛瘘手术治疗均未治愈;(3)年龄30～50 岁;(4)无糖尿病、高血压、严重慢性肝肾功能不全等基础疾病;(5)患者签署知情同意书,并符合医学伦理学相关规定。排除标准:(1)精神障碍患者;(2)严重心肺及肝肾功能不全患者或孕妇。

1.3 方法 (1)分组及取材:将6例患者按照入院先后顺序随机分为3组,每组各2例,每例患者均取手术切除的瘘管组织标本及瘘管远端正常组织标本,形成自身配对对比。标本采集后,采用PBS缓冲液反复冲洗血污,直至冲洗液接近无色,然后立即将组织置于冻存管液氮预处理,随后放入干冰中保存转运。最终将3组测序结果进行整合分析。(2)实验流程按照Illumina公司提供的标准步骤执行,包括制备文库和测序实验。小RNA测序文库制备采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits(Illumina,San Diego,USA)试剂盒。文库制备工作完成后,对构建好的文库使用 Illumina Hiseq2500 进行测序,测序读长为单端 1X50bp。

1.4 信息分析流程

1.4.1 miRNA差异表达分析:本研究采用浙江杭州联川生物自主开发的ACGT101-miR(LC Sciences,Houston,Texas,USA)软件,该软件的分析流程如下:①去除3’接头和垃圾序列:获取clean data;②长度筛选:保留碱基长度在18-26nt的序列;③各种RNA数据库比对分析:将剩余序列比对(不包含miRNA)mRNA、RFam和Repbase数据库,并进行过滤;④miRNA鉴定:获取有效数据,并比对前体和基因组进行miRNA鉴定;⑤采用T检验,进行miRNA差异性分析。

1.4.2 差异性miRNA靶基因预测分析:针对动物物种,使用TargetScan、miRanda两款软件对显著性差异的miRNA分别进行靶基因预测。对两款软件预测出的靶基因分别按照每款软件的评分标准进行筛选。TargetScan算法中去除context score percentile<50的靶基因,miRanda算法中去除最大自由能(Max Energy)>-10的靶基因。最后取此两款软件的交集作为差异miRNA的最终靶基因。

1.4.3 富集分析:富集分析主要包括两部分,一部分是GO功能注释,一部分是KEGG Pathway功能注释。首先把所有选定miRNA对应的靶基因对应于每个功能或者每个通路注释的gene数目统计出来,然后应用超几何检验,找出与所有选定miRNA对应的靶基因mRNA与注释库中的GO或者KEGG pathway对应的gene数量(全部具备功能注释的基因,或者全部具备功能注释的miRNA靶基因)相比,计算得到P-value ≤ 0.05为阈值,满足此条件的功能定义为miRNA-mRNA关系对中显著富集的功能。通过功能显著性富集分析能确定miRNA-mRNA关系对行使的主要生物学功能。

2 结果

2.1 差异miRNA表达水平分析 本研究共测得1116个差异表达的miRNA,共20个miRNA表达水平差异具有统计学意义(P<0.05),其中hsa-miR-432-3p、hsa-miR-181b-5p_R+1和hsa-miR-30d-3p表达水平具有明显差异(P<0.01)。在表达水平升高的miRNA中,hsa-miR-2355-3p在肛瘘瘘管壁组织中表达水平是远端正常组织的7.07倍,hsa-miR-3910在肛瘘瘘管壁组织中表达水平是远端正常组织的3.01倍,bta-miR-2478_L-1_1ss2TA在肛瘘瘘管壁组织中表达水平是远端正常组织的2.99倍;在表达水平降低的miRNA中,hsa-miR-1277-3p在肛瘘瘘管壁组织中表达水平仅占远端正常组织的8%,hsa-miR-616-5p在肛瘘瘘管壁组织中表达水平仅占远端正常组织的10%,hsa-miR-223-5p_R+1在肛瘘瘘管壁组织中表达水平仅占远端正常组织的39%。见图1～4,表1。

表1 差异表达的miRNA

图1 20个差异表达miRNA的聚类分析图

图2 差异表达miRNA火山图 图3 差异表达miRNA韦恩图 图4 2组差异表达的miRNA

2.2 靶基因预测及富集分析结果

2.2.1 靶基因预测:对差异表达的20个miRNA进行靶基因预测,结果显示20个miRNA均预测到靶基因,共计预测到85510个靶基因。其中表达水平差异较显著的hsa-miR-432-3p所预测到的评分较高的主要靶基因包括MSTN、ITGAV、YPEL5、LARS1、ASB15等,hsa-miR-181b-5p_R+1所预测到评分较高的主要靶基因包括YTHDC2、RPS6KB1、KLHL2、IL2、PRDM4等,hsa-miR-30d-3p所预测到评分较高的主要靶基因包括CCN3、DNAJC27、ZCCHC14、GLRA3、FSTL1等。

2.2.2 GO富集分析:结果显示,每个基因参与的子条目分别是:生物功能、细胞组分、分子功能。本研究有差异表达的20个miRNA靶基因参与的生物过程包括:转移酶活性、调控转录、三磷酸腺苷结合、金属离子结合、DNA结合、核酸结合、核苷酸结合、细胞骨架、细胞投影、细胞连接、RNA聚合酶对转录的正调控作用、胞内信号转导等。细胞组分:细胞核、核质、细胞质、细胞溶质。分子功能:激酶。见图5、6。

图5 GO富集分析

图6 GO富集分析结果统计图

2.2.3 KEGG富集分析:通过KEGG富集分析显示,与本研究中差异表达的20个miRNA密切相关的信号通路主要包括癌通路、癌症中的蛋白聚糖、磷脂酰肌醇信号系统、胰腺癌、神经营养因子信号通路、长时程抑制、炎症介质调节TRP通道、肝细胞癌、谷氨酸突触、黏着斑、慢性粒细胞白血病以及Ras、Rap1、PI3K-Akt、cAMP、MAPK、Hippo、ErBb、Calcium、Apelin等通路。见图7。

图7 KEGG富集分析

3 讨论

肛瘘作为临床的常见病、多发病,目前主要通过手术治疗,然而由于肛门解剖位置的特殊性,常导致术后创面难愈且并发症较多,是肛肠外科医生所面临的巨大难题。MicroRNAs(miRNAs)是大小为19～25个核苷酸的内源性小RNA,作为一种新兴的研究领域逐渐成为研究的热点。20多年前,第一个微小RNA(miRNA)的发现开启了分子生物学的新纪元。迄今为止,已经在人类中发现了2000多种miRNA,它们可通过抑制mRNA翻译或促进mRNA降解,从而调控人类基因组中约三分之一的基因。一种miRNA 可以同时靶向位于同一细胞信号通路中的多个基因[8-10]。miRNA与许多人类疾病有关,已被广泛用作临床诊断和治疗的靶点。对于生物学家来说,定义 miRNA 的目标集是理解其生物学作用的关键;而对于开发 miRNA 疗法的医学学者而言,经过验证的靶标为确定 miRNA 模拟物或抑制剂的功效提供了最佳生物标志物。因此,对疾病的特征性miRNA 及其靶基因、信号通路、生物功能等方面的研究显得十分重要[11]。

miRNA 靶点预测在整个工作流程中占据核心位置,是揭示 miRNA 功能并将 miRNA 与其他 RNA(mRNA、lncRNA 和 circRNA)联系起来的关键步骤。本研究采用基因测序技术,共测得20个差异有统计学意义的特征性miRNA。通过靶基因预测,并进一步GO及KEGG富集分析,结果显示,本研究得到的差异表达的20个miRNA靶基因所参与的生物过程主要包括:转移酶活性、调控转录、三磷酸腺苷结合、金属离子结合、DNA结合、核酸结合、核苷酸结合、细胞骨架、细胞投影、细胞连接、RNA聚合酶对转录的正调控作用、胞内信号转导等,细胞组分主要包括细胞核、核质、细胞质、细胞溶质,分子功能主要包括激酶。与本研究中差异表达的20个miRNA密切相关的信号通路主要包括癌通路、癌症中的蛋白聚糖、磷脂酰肌醇信号系统、胰腺癌、神经营养因子信号通路、长时程抑制、炎症介质调节TRP通道、肝细胞癌、谷氨酸突触、黏着斑、慢性粒细胞白血病以及Ras、Rap1、PI3K-Akt、cAMP、MAPK、Hippo、ErBb、Calcium、Apelin等通路。

研究发现MAPK-RAS信号通路与细胞生长、分化、增殖、凋亡和迁移功能密切相关,与癌症的发生发展联系密切,被认为是癌症治疗的潜在治疗靶点[12]。此外,刘宏伟等[13,14]研究发现,RAS通路在慢性难愈性创面中,对促进皮肤损伤修复和再生发挥重要调控作用。不仅如此,多项研究表明,增强 RAS/RAF/ERK 信号通路的活性,可显著促进血管新生,从而促进创面愈合[15-21]。PI3K-Akt 信号通路涉及许多生物过程,包括细胞周期、细胞凋亡、血管生成和葡萄糖代谢[22]。PI3K/Akt 通路是细胞增殖和凋亡必不可少的途径,在肿瘤的发生发展中起着重要作用[23]。已经证实抑制PI3K/Akt可以抑制肿瘤细胞增殖并在体外和体内诱导细胞凋亡。PI3K抑制剂可能靶向肿瘤血管生成以增强癌症治疗,也可能是靶向伤口血管生成,促进创面愈合的靶点。由上可知,RAS、MAPK、PI3K-Akt等通路的抑制也可能是肛瘘术后创面难愈的机制之一,上述通路也可能成为促进肛瘘术后创面愈合的治疗靶点之一。近期研究发现,Rap1可能会拮抗 Ras蛋白,要么通过竞争共同目标,要么通过作为G蛋白转导抑制性生长信号,对抗成纤维细胞中的Ras生长促进信号[24]。因此,Rap1的过表达,可能会延迟创面的愈合。环磷酸腺苷(cAMP)是第一个发现的第二信使,在细胞信号传导中起关键作用,并调节许多生理和病理过程。cAMP 可以调节多种靶基因的转录,主要通过蛋白激酶 A(PKA)及其下游效应子如 cAMP 响应元件结合蛋白(CREB)。此外,PKA 可以磷酸化多种激酶,如 Raf、GSK3 和 FAK。异常的 cAMP-PKA 信号传导涉及各种类型的人类肿瘤。cAMP-PKA 信号可以调节癌细胞的生长、迁移、侵袭和代谢[25],值得注意的是,cAMP 信号既可能具有肿瘤抑制作用,又可能具有肿瘤促进作用,具体取决于肿瘤类型和背景。cAMP主要通过PKA、Epac1 和 Epac2调节多个细胞过程,包括迁移和黏着斑形成、心输出量、神经递质释放、葡萄糖稳态、胞吐作用、细胞增殖、细胞分化和细胞存活[26]。Hippo通路是一种进化上保守的信号通路,在器官发育、上皮稳态、组织再生、伤口愈合和免疫调节中起关键作用[27]。YAP/TAZ是Hippo通路的成员之一,YAP/TAZ在基底层干细胞控制中的作用在表皮发育和皮肤创伤修复中都很明显。在皮肤基底层观察到核YAP和TAZ定位,表达水平在伤口愈合时明显升高。实验证明,成年小鼠特异性敲除Yap1和Wwtr1后,皮肤组织损伤后的再生受到严重影响[28,29],提示YAP/TAZ活性在皮肤稳态中是必不可少的,因为Yap1/SWwtr1缺失使基底层细胞增殖减慢,导致组织损伤[30]。

然而,本研究结果与其他研究结果也存在一定差异,裘建明等[7]通过检测对比肛瘘并发混合痔的患者与单纯混合痔患者手术切除的痔核近端肛管粘膜标本,共得出13个差异表达的miRNA,两项研究结果有且仅有一个miRNA相同,即hsa-miR-181a-2-3p。考虑出现此差异的原因主要与两个研究所采用的标本及检测技术不同相关。目前诸多检测分析所得出的miRNA结果存在较大的差异,也是限制miRNA进一步研究的重要因素。

综上所述,通过对肛瘘瘘管壁组织中特征性表达miRNA的检测分析,发现大量与创面愈合密切相关的信号通路,提示Ras、PI3K-Akt、cAMP、MAPK、Hippo等通路的抑制,可能是肛瘘术后创面难愈的原因之一,这也与肛瘘术后创面属于慢性难愈性创面的特点不谋而合。同时,Ras、PI3K-Akt、cAMP、MAPK、Hippo等通路也可能成为促进肛瘘术后创面愈合的潜在靶点,对于肛瘘的诊治具有一定的指导意义。