王佳鸾,赵俸艺,吴文龙,李维林,张春红
(1 江苏省中国科学院植物研究所,南京,210014;2 南京林业大学,南京,210037)
黑莓(blackberry)为蔷薇科悬钩子属(RubusL.)多年生小浆果果树,原产于北美[1],1986年由江苏省中国科学院植物研究所引入国内[2]。黑莓较适应我国南方地区环境,现主要在江苏及周边区域大面积推广种植[3]。黑莓果实为聚合型浆果,营养丰富,色泽艳丽,口味香醇。黑莓果实含有多种营养物质如酚酸类、糖类、维生素以及矿物质等[4],且其生物活性成分具有抗氧化[5-7]、抗癌[8-9]、抗炎[10]、抑菌[11]以及保健功效[12]等多种生理功能。鞣花酸为没食子酸二聚体,是一种天然的多酚二内酯[13],在生物体内有游离态与结合态存在形式。鞣花酸可自身聚合形成单宁,也可与糖结合形成糖苷[14]。鞣花酸具有十分广谱的生物活性,如抗癌[15-16]、抗炎[17-18]、抗氧化[19]、抑菌[20]以及保健功效[21-22]等。鞣花酸因其特殊的理化性质导致其在多种溶剂中溶解度不高[23],且在植物体内含量较低。国内在悬钩子树莓果实鞣花酸提取纯化研究方面已有一定成果[24-25],同时对鞣花酸生物活性也开展了初步探讨[26],国外有研究对树莓鞣花酸提取物的生物活性以及其作用机制进行了报道[27]。国内近期有学者详尽报道了掌叶覆盆子果实发育进程中鞣花酸合成积累的规律[28]。国内还对悬钩子优秀品种的繁育进行了大量研究[29]。目前,尚未见黑莓果实鞣花酸含量累积规律及合成的相关报道。
“宁植3号”(苏鉴果201507)和“宁植4号”(苏S-SV-RS-014-2020)均为国内培育和审定的黑莓优良品种,两者均具优良特性,在生产上彰显出良好的推广前景。“宁植3号”由“Arapaho”(♀)和“Hull”(♂)杂交选育而成,早熟丰产,且果实为近圆形[30]。“宁植4号”由“Kiowa”(♀)和“Hull”(♂)通过杂交选育而成,植株无刺,生产势极强,丰产,中晚熟,且果实较大[31]。本研究对“宁植3号”和“宁植4号”黑莓品种不同时期果实开展抗氧化活性物质以及糖类物质的含量变化分析,尤其着眼于不同抗氧化成分与果实鞣花酸含量的相关关系,以期为自育优良黑莓品种不同时期果实的综合开发利用提供参考。
1.1 试验材料黑莓品种“宁植3号”和“宁植4号”均为江苏省中国科学院植物研究所溧水白马科学基地自主繁育的优良品种,分别在2个品种3年生大树果实的青果期(S1)、青转红期(S2)、红果期(S3)、红转黑期(S4)及果实转黑成熟期(S5)采摘颜色一致、无病虫害的健康果实,S1—S2时期果实为2021年5月17日采摘,S3—S5时期果实为2021年6月11日采摘,低温运输至实验室后测定各项生长指标和抗氧化物质含量等。
鞣花酸标准品(含量>96%,仅用作对照分析,上海源叶生物科技有限公司),NaOH(分析纯,四川西陇科学有限公司),乙醇(分析纯,华大化学集团有限公司),DPPH自由基清除能力试剂盒、总抗氧化能力测定试剂盒、维生素C测定试剂盒、类黄酮试剂盒、可溶性糖试剂盒、蔗糖测试盒、葡萄糖试剂盒、果糖试剂盒(购自南京建成生物有限公司)。
1.2 生长指标和抗氧化指标测定果实生长指标测定:随机选取30粒无病虫害的果实,用感量0.01 g的电子天平称取单果质量,用精度为0.01 mm的数显游标卡尺测定果实横径和纵径,重复测定3次。
果实糖类物质含量测定:称取50 g鲜果,匀浆后备用。可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法,糖在浓硫酸的作用下可以脱水形成糖醛或羟甲基糖醛,与蒽酮发生反应后生成蓝绿色糠醛衍生物,在620 nm处有最大吸收峰。果糖含量测定采用紫外分光光度法,果糖与试剂盒中基质液反应,在285 nm处有最大吸收峰。葡萄糖含量测定采用葡萄糖氧化酶法,葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下生成D-葡萄糖酸,D-葡萄糖酸与4-氨基安替比林在过氧化物酶的作用下产生紫红色色素,在505 nm处有最大吸收峰。
果实鞣花酸含量测定:称取50 g鲜果,匀浆后备用。采用超声辅助溶剂提取法提取鞣花酸。采用前人报道方法[32],取1 g果浆加入40%乙醇14 mL,超声提取20 min,提取温度设定为80 ℃,之后7 000 转/min离心10 min,上清液即为鞣花酸粗提液。鞣花酸测定采用紫外分光光度法[33],取粗提液1 mL加入0.1 mol/L NaOH溶液4 mL,室温反应15 min,于357 nm处测定吸光值,通过标准曲线(y=0.0504x+0.003)计算鞣花酸含量。
果实抗氧化物质含量测定:采用超声辅助溶剂提取法提取花色苷,采用紫外分光光度法在510 nm处对其含量进行测定[34]。DPPH自由基清除能力采用比色法测定。DPPH自由基有单电子,其甲醇溶液呈紫色,在517 nm处有最大吸收峰,自由基清除剂可以与其单电子配对使其吸收值逐渐降低,结果用每克鲜果能去除抗氧化剂Trolox的量来表示。总抗氧化能力采用比色法测定,抗氧化物质可以使Fe3+还原成Fe2+,Fe2+可以与菲啉类物质形成络合物,在520 nm处测定吸光值,反应后每当吸光度值增加0.01时表示其含有一个抗氧化能力单位(U),结果用U/mg表示。维生素E和维生素C测定均采用比色法,其均可将Fe3+还原成Fe2+,Fe2+可与菲罗啉结合形成有颜色物质,分别在533 nm、536 nm处测定吸光值。
1.3 数据分析采用SPSS 17.0进行显著性分析和相关性分析。
2.1 果实生长指标变化在发育进程中,“宁植3号”和“宁植4号”的果实单果质量、横径和纵径增长模式相近,区别在于“宁植3号”果实进入迅速膨大期的时期(S2期之后)晚于“宁植4号”(S2期之前),果实要小些。此外,“宁植3号”果实横、纵径较接近,而“宁植4号”果实纵、横径差异较大(见图1)。
注:S1为青果期,S2为青转红期,S3为红果期,S4为红转黑期,S5为转黑成熟期。
2.2 果实鞣花酸含量变化在发育进程中,2个品种果实鞣花酸含量均呈先急剧下降后小幅回升的变化趋势。“宁植3号”果实鞣花酸含量在S1至S3期间下降明显,之后变化较小;“宁植4号”果实鞣花酸在S1至S2期间急剧下降,此后变化较平缓。“宁植3号”在红转黑期(S4)最低,而“宁植4号”在红果期(S3)含量最低,成熟期(S5)含量(分别为0.99 mg/g和0.72 mg/g)均显著低于青果期(分别为2.60和3.19 mg/g)(见图2)。
图2 不同着色期“宁植3号”“宁植4号”黑莓果实鞣花酸含量
2.3 果实糖类物质含量变化在发育进程中,2个品种果实可溶性糖、葡萄糖和果糖均呈逐渐增加的趋势,直至成熟期(S5)时达最高值,3种糖类物质均在S4至S5期间快速积累。S4期及以前“宁植3号”的3种糖类物质含量总体上低于“宁植4号”,S5期(成熟期)“宁植3号”的3种糖类物质含量均高于“宁植4号”(见图3)。
图3 不同着色期“宁植3号”“宁植4号”黑莓果实糖类物质含量
2.4 果实抗氧化能力变化在发育进程中,2个品种果实的总抗氧化能力和DPPH自由基清除能力均呈逐步下降趋势。“宁植3号”的总抗氧化能力在S1至S2期较高且近乎不变,S2至S3期间急剧下降,之后又小幅上升;“宁植4号”的总抗氧化能力在S1至S2期间急剧下降,此后变化较平缓。“宁植3号”“宁植4号”S1时期果实抗氧化能力(分别达473.33和775.02 U/mg)分别显著高于S5(分别为244.18和151.98 U/mg)。“宁植3号”的DPPH自由基清除能力在S1至S3期间下降较明显,此后变化平缓;“宁植4号”的DPPH自由基清除能力下降速度较稳定。两个品种S1期的DPPH自由基清除能力(274.45和121.46 mg/g)均显著高于S5(分别为53.27和37.55 mg/g)(见图4)。
图4 不同着色期“宁植3号”“宁植4号”黑莓果实总抗氧化能力和DPPH自由基清除能力
在发育进程中,“宁植3号”“宁植4号”果实花色苷积累呈逐渐上升趋势,尤其是在S4至S5期间快速积累,S5期时含量达最高(分别为1.80和1.60 mg/g)。植物总酚含量均呈逐渐下降趋势,S1期分别为68.92和80.99 mg/g,S5期分别为25.67和20.59 mg/g。维生素E变化与总酚类似,S1期最高(分别为425.19和263.14 μg/g),之后均呈下降趋势。维生素C表现为先下降后上升的趋势,“宁植3号”在S5期最高(65.31 μg/mg),“宁植4号”在S1和S5期接近(分别为59.53和54.85 μg/mg)(见图5)。
图5 不同着色期“宁植3号”“宁植4号”黑莓果实4种抗氧化物质的含量
2.5 果实鞣花酸含量与其他指标的相关性鞣花酸具有抗氧化以及清除自由基的能力[19]。鞣花酸合成通路为莽草酸途径,起始于4-磷酸赤藓糖和磷酸烯醇式丙酮酸的缩合[28],鞣花酸可以与糖类物质缩合形成糖苷,所以糖类物质对游离鞣花酸含量具有一定影响。此外,糖类物质、其他酚酸类物质以及黄酮类物质的合成均与磷酸烯醇式丙酮酸相关,磷酸烯醇式丙酮酸也参与糖类物质的代谢与合成。对2个品种各时期果实鞣花酸含量与其他指标进行相关性分析的结果表明,2个品种果实纵径均与鞣花酸含量呈显著负相关,总抗氧化能力与果实鞣花酸含量呈显著(“宁植3号”)或极显著(“宁植4号”)正相关;“宁植3号”的DPPH自由基清除能力和维生素E含量分别与鞣花酸含量呈极显著正相关;“宁植4号”果实横径与鞣花酸含量呈显著负相关,总酚含量与鞣花酸含量呈显著正相关。(见表1)。
表1 黑莓果实着色进程中各品质指标与鞣花酸含量的相关性分析
黑莓果实营养物质含量丰富,不同品种及不同发育期其主要活性成分的含量也有差异[35]。目前关于黑莓鞣花酸研究的报道仍较少,且研究主要集中在成熟果实鞣花酸分离纯化[36-37]、鞣花酸提取工艺[38]及鞣花酸含量测定[39]等方面,尚未见鞣花酸在黑莓果实发育过程中变化规律的研究报道。基于此,本研究对2个品种黑莓果实发育进程中鞣花酸含量变化进行了分析比较,并分析了其他抗氧化物质含量及糖类物质含量的变化。结果发现,鞣花酸含量随果实发育进程先急剧下降后小幅回升,总体下降,转色前青果期的含量明显高于其他时期,成熟果实中鞣花酸含量较低。他人发现红树莓成熟果实的鞣花酸含量明显低于其他组织[40]。黑莓成熟果实中鞣花酸含量较低的原因,可能与成熟果实中水分含量增加及鞣花酸与糖进行部分结合有关[14]。同时,本试验中黑莓成熟果实鞣花酸含量明显高于红树莓[40-41]、黑树莓[41]和蓝莓[41]成熟果实,与黑莓果实中总酚和总黄酮均高于红树莓和紫树莓果实的情况[42]一致,这暗示黑莓在鞣花酸合成方面与其他悬钩子果实相比可能具有一定特异性。
在本研究中,黑莓果实鞣花酸含量、抗氧化能力及主要抗氧化物质总酚和维生素E含量总体变化趋势相似,均随果实的成熟而下降,而花色苷和糖类物质的变化与此相反。这与悬钩子果实已有相关研究结果一致,即黑莓不同品种果实抗氧化能力及抗氧化物质含量随成熟度上升均出现下降[42],黄树莓DPPH自由基清除能力及总酚含量在青果期最高[43],还与石榴果实鞣花酸含量、抗氧化能力以及抗氧化物质积累随果实生长发育进程均呈下降趋势的研究结果[44-45]一致。此外,草果糖类物质在果实发育进程中逐渐积累且与鞣花酸含量呈负相关[46],火龙果糖类物质含量以幼果最低且逐渐上升[47],均与本研究结果类似。这表明糖类物质在成熟果实中含量较高,使得风味较好,而果实抗氧化物质以青果期含量较高。
作为一种良好的植物抗氧化剂,鞣花酸在黑莓青果期果实中含量最高,果实总酚、维生素E及抗氧化指标含量也与鞣花酸含量呈明显的正相关,从黑莓青果中可加工开发出更多有益于人体的活性物质。随着果实发育成熟,黑莓果实中糖类物质及花色苷含量不断升高,更适于鲜食利用。