基于生物信息学构建肝细胞癌预后相关circRNA-miRNA-mRNA调控网络

袁浩桐，姜博文，李真鹏，井媛旭，袁硕，杨超

（齐齐哈尔医学院 1.口腔医学院；2.医学技术学院生物化学教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其病死率位居恶性肿瘤第3位［1］。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的肝癌类型，约占肝癌的90%［2］。手术切除和肝移植是肝癌患者的根治性疗法，但术后转移及复发风险高，预后极差［3］。因此，深入探究肝癌发病机制，积极寻找肝癌早期分子标志物，对提高肝癌的预后有重要意义。

环状RNA（circle RNA，circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子，首尾相接形成闭合的圆环，不易被RNA酶降解，被认为是有潜力的生物标志物［4］。circRNA可通过竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）机制，影响肝癌的发生和发展。HUANG等［5］发现circRNA_104348可通过吸附miR-187-3p，上调靶基因RTKN2的表达，促进肝癌细胞的增殖和迁移。但circRNA在肝癌中的研究仍处于初级阶段，有待进一步探讨［6］。

本研究基于基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库中下载的数据集GSE97332和GSE164803，筛选出肝癌相关差异表达circRNA，并构建肝癌预后相关ceRNA调控网络，为深入挖掘肝癌发生的分子机制，寻找肝癌潜在的circRNA诊断标志物提供一定的研究依据。

1 材料与方法

1.1 HCC芯片数据的收集

HCC相关circRNA表达谱数据下载自GEO数据库（http：//www.ncbi.nlm.gov/geo/）。数据集GSE97332包括7例HCC样本和7例肝正常组织样本，芯片平台为GPL19978；GSE164803包括6例HCC样本和6例肝正常组织样本，芯片平台同为GPL19978。

1.2 HCC相关差异表达circRNA的筛选

采用GEO2R在线工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/），以校正后的P<0.05、|log2FC|>2为标准，筛选数据集GSE97332及GSE164803中的差异表达circRNA，交集分析得到共差异表达circRNA。

1.3 预测与circRNA相结合的微RNA（microRNA，miRNA）

分别在Circular RNA Interactome（https：//circinteractome.nia.nih.gov/）与circBank（http：//www.circbank.cn）数据库中预测与共差异表达circRNA相结合的miRNA，所得结果取交集作为后续研究的miRNA。

1.4 构建circRNA-miRNA-mRNA网络

分别在miRDB（http：//mirdb.org/）、RNAInter（https：//www.rna-society.org/rnainter/）、Targetscan（http：//www.targetscan.org/）数据库中预测miRNA的下游靶基因mRNA。交集分析确定miRNA最终调控基因。依据ceRNA理论构建circRNA-miRNA-mRNA网络，并用Cytoscape3.7.2软件（http：//www.cytoscape.org/）将网络可视化展示。

1.5 靶基因功能富集分析和通路富集分析

利 用DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）对筛选出的靶基因进行基因本体（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，富集标准为P<0.01，基因数>10。

1.6 构建靶基因蛋白质-蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction networks，PPI）并筛选核心基因

在STRING数据库（https：//string-db.org/）中查询靶基因的蛋白质互作信息，以PPI combined score>0.4为阈值条件，在Cytoscape3.7.2软件中构建PPI网络，应用CytoHubba插件中的Degree算法，选择前10 位基因作为核心基因。

1.7 核心基因生存分析

应用基于基因表达水平值的交互式分析平台（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）对核心靶基因进行生存分析，肿瘤类型选择“liver hepatocellular carcinoma，LIHC”，检测核心基因的表达对肝癌患者总生存率的影响，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 筛选HCC差异表达circRNA

应用GEO2R对HCC相关circRNA数据集进行差异表达circRNA筛选，以校正后P<0.05，|log2FC|>2为标准，从GSE97332中得到147个差异表达的circRNA，其中，上调97个，下调50个（图1A）；从GSE164803中得到67个差异表达的circRNA，其中，上调22个，下调45个（图1B），将2组数据取交集仅得到1个共差异表达circRNA：hsa_circRNA_0000301，将其作为后续研究对象。

图1 GSE97332与GSE164803差异表达circRNA火山图Fig.1 Volcano map of differentially expressed circRNAs in GSE97332 and GSE164803

2.2 构建HCC相关circRNA-miRNA-mRNA调控网络

采用生物信息学软件Circular RNA Interactome及circBank来预测与hsa_circRNA_0000301结合的miRNA，结果显示，通过Circular RNA Interactome 得到8个与hsa_circRNA_0000301互作的miRNA，通过circBank得到26个与hsa_circRNA_0000301互作的miRNA（表1），交集分析得到4个miRNA，即hsa-miR-377-3p、hsa-miR-767-3p、hsa-miR-1178-3p及hsamiR-1228-3p。

表1 生物信息学预测与hsa_circRNA_0000301相结合的miRNATab.1 Bioinformatics prediction of miRNAs associated with hsa_circRNA_0000301

采用miRDB、RNAInter、TargetScan数据库预测上述4个miRNA的靶基因，交集分析确定miRNA最终调控基因。结果显示，hsa-miR-377-3p的靶基因有296个，hsa-miR-767-3p的靶基因有260个，hsa-miR-1178-3p的靶基因有154个，hsa-miR-1228-3p的靶基因有144个（图2）。将4个miRNA的靶基因汇总去重后，最终得到813个靶基因。采用Cytoscape软件构建肝癌相关circRNA-miRNA-mRNA调控网络图。网络中包含1个circRNA节点、4个miRNA节点、813个mRNA节点和858条边。

图2 应用miRDB、RNAInter、TargetScan数据库预测miRNA的靶基因Fig.2 Target genes of miRNAs were predicted using miRDB，RNAInter，and TargetScan databases

2.3 靶基因功能富集分析

应用DAVID数据库对与813个靶基因进行GO功能和KEGG通路富集分析。GO分析结果显示，有15个生物学过程存在富集，主要包括RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控、泛素依赖性蛋白质分解代谢过程、细胞对缺氧的反应等；10个细胞组分存在富集，主要有突触后膜、双细胞的紧密连接、核内体等；13个分子功能存在富集，主要有蛋白激酶结合、序列特异性DNA结合、RNA聚合酶Ⅱ核心启动子近端区域序列特异性DNA结合等（图3）。KEGG分析结果显示，hsa_circRNA_0000301在6个通路中富集，包括与肝癌发生密切相关的MAPK信号通路、FoxO信号通路、Wnt信号通路等（图4）。

图3 GO功能富集结果Fig.3 Gene ontology enrichment analysis results

图4 KEGG通路富集分析结果Fig.4 Results of KEGG pathway enrichment analysis

2.4 筛选核心靶基因

在STRING数据库中查询813个靶基因的蛋白质互作关系，构建PPI网络，应用Cytoscape中的CytoHubba插件，筛选出的10个核心基因为EGFR、STAT3、SMAD2、HIF1A、MTOR、EIF4E、NR3C1、PRKACB、NRAS、CHD4。

2.5 核心靶基因生存分析

应用GEPIA数据库查询核心基因与肝癌患者预后的关系，结果显示，EIF4E、PRKACB、NRAS这3个基因高表达患者的总生存率均明显低于低表达患者，差异有统计学意义（P<0.05），其他7个基因对肝癌患者总生存率的影响不显著（图5）。

图5 核心基因生存分析曲线Fig.5 Survival analysis curves of core genes

2.6 构建HCC预后相关circRNA-miRNA-核心靶基因调控网络

在cytoscape软件中构建HCC预后相关circRNAmiRNA-核心靶基因调控网络，网络由1个circRNA节点、2个miRNA节点、3个预后相关核心靶基因节点组成（图6）。

图6 HCC预后相关circRNA-miRNA-核心靶基因网络图Fig.6 Network of circRNA-miRNA-core target genes related to the prognosis of HCC

3 讨论

肝癌具有难诊断、难治疗、易转移、易复发等临床特点［7］，除早期可进行手术切除和肝移植外，几乎无根治性治疗方法。因此，深入探讨肝癌发病机制，寻找肝癌新的特异性生物靶点，实现早期诊断和治疗尤为重要。circRNA由于其自身性质稳定、表达具有时空特异性等天然优势，具有成为肿瘤生物标志物的先天条件［8］。近来研究［9］表明，circRNA在肝癌等多种癌症中异常表达，通过ceRNA机制吸附miRNA参与肿瘤的发生发展。

本研究通过对数据集GSE97332和GSE164803进行差异表达分析，筛选出1个circRNA：hsa_circRNA_0000301，提示该circRNA在HCC中具有一定的特异性。研究［10］表明，circRNA_0000301位于11号染色体上，其亲本基因为SPL1，circRNA_0000301参与乳腺癌的发生发展，但其在肝癌中的作用尚不清楚。进一步预测出与circRNA_0000301相结合的miRNA及下游靶基因，并构建ceRNA网络图。应用DAVID数据库对靶基因进行GO和KEGG功能富集分析，最后通过PPI网络及预后分析筛选出3个预后相关核心靶基因，分别为EIF4E、PRKACB和NRAS，并构建出circRNA-miRNA-核心靶基因调控网络。

GO分析结果显示，靶基因在RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控、泛素依赖性蛋白质分解代谢过程等功能存在富集。研究［11-13］表明，泛素介导的蛋白水解在肿瘤发生中发挥重要作用，如参与调节细胞周期进展、肿瘤转移等。KEGG分析结果表明靶基因可能在与HCC发生密切相关的MAPK信号通路、FoxO信号通路、Wnt信号通路中发挥作用。细胞内信号通路的失调可引起细胞增殖与凋亡异常，导致细胞癌变的发生［14］。

研究［15］表明，EIF4E基因编码在真核翻译起始中起关键作用的蛋白分子，EIF4E的高表达可诱导细胞周期、细胞生长和血管生成等相关蛋白的表达上调，影响癌症的发生发展。据报道［16］，EIF4E在HCC样本中表达升高，且与患者的不良预后相关，可作为肝癌患者的独立预后指标。PRKACB基因编码cAMP依赖性蛋白激酶催化亚单位 β，该蛋白是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员之一，可调控细胞增殖、分化等多种细胞进程，参与肿瘤的生长及转移。YE等［17］研究发现，miR-302可靶向PRKACB抑制肝癌细胞的增殖和迁移。NRAS基因编码的N-Ras蛋白参与RAS/MAPK信号通路，调控细胞生长、增殖等过程。索拉菲尼是肝癌治疗的一线药物，研究［18］发现，NRAS在索拉菲尼耐药的肝癌细胞中显著高表达，敲除NRAS后可增强拉索菲尼对耐药细胞的治疗效果。

综上所述，本研究由生物信息学方法筛选出的3个HCC预后相关基因均在HCC的发生发展中发挥重要作用。本研究首次发现了可能与HCC发生密切相关的circRNA（hsa_circRNA_0000301），并构建出与HCC预后相关的circRNA-miRNA-核心靶基因ceRNA调控网络，为进一步挖掘肝癌发生的分子机制，寻找HCC潜在的circRNA诊断标志物提供一定的研究依据。