益气养阴活血方对肺纤维化大鼠TGF-β1、Smad3、MMP9及TIMP1表达的影响

周世琴 ，骆亚莉，2，张秋菊 ，周雯 ，肖孟勇 ，齐晓风 ，刘永琦

1.甘肃中医药大学基础医学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室，甘肃 兰州 730000

肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）是一种慢性、进行性的呈纤维化间质性肺炎[1]。流行病学研究表明，全球有超过500 万PF 患者，发病率及病死率逐步升高[2]，其中位生存时间仅3～5年[3-4]。西药具有一定疗效，但存在不良反应，患者的生活质量及生存率未能得到明显改善[5]。

中医药“多点起效、协同作用”，且不良反应少，在PF防治中显示出优势[6]。研发防治PF的中药制剂对提高患者生存率具有重要意义。中医学认为，气虚、阴亏、血瘀是PF的主要病机[7-8]。本课题组结合前期研究基础[9-10]，在《医学心悟》黄芪汤基础上加当归组成益气养阴活血方，切合肺纤维化“气虚、阴亏、血瘀”病机。研究表明，TGF-β1/Smad信号通路在PF过程中有重要作用[11]。本研究观察益气养阴活血方对PF大鼠转化生长因子-β1（TGF-β1）、Smad3、基质金属蛋白酶9（MMP9）及基质金属蛋白酶抑制剂1（TIMP1）表达的影响，初步探讨该方改善PF的作用机制，为其临床应用提供依据。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠48只，体质量（180±20）g，斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，动物许可证号SYXK（京）2020-0009，饲养于甘肃中医药大学实验动物中心。实验操作遵循动物实验伦理规范，本实验经甘肃中医药大学实验动物伦理委员会审批（2021-889）。

1.2 药物及制备

益气养阴活血方由黄芪30 g、当归15 g、熟地黄15 g、麦冬15 g、枸杞子10 g、五味子10 g、人参15 g组成，免煎颗粒购于甘肃中医药大学第二附属医院。将免煎颗粒用生理盐水溶解，制成浓度分别为1.980、0.99、0.495 g/mL混悬液备用。醋酸泼尼松片，批号211007，5 mg/片，山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司。注射用盐酸博来霉素，批号Y00720，日本化药株式会社。

1.3 试剂与仪器

4%多聚甲醛、TriQuick Reagent总RNA提取试剂盒（批号分别为P1110、R1100），北京索莱宝生物；HE 染色试剂盒、Masson 染色试剂盒（批号分别为G1003、G1006），武汉塞维尔公司；MMP9、TIMP1、纤连蛋白（FN）抗体（批号分别为AF7935、AF8163、AF6912），上海碧云天生物；层粘连蛋白（LN）抗体（批号GTX27463），GeneTex公司；TGF-β1、Smad3、p-Smad3 抗体（批号分别为YT4632、YT4334、YP0585），美国Immunoway公司。

肺功能检测系统（型号WPB PLT-UNR-RT-2，德国EMKA公司），荧光定量PCR仪（型号CFX96，美国Bio-Rad公司），凝胶成像分析系统（型号CHEMI DOC XRS，美国Bio-Rad公司），倒置荧光显微镜（型号MF53-N，广州明美光电），台式高速离心机（型号D-37520，美国Thermo），-80 ℃低温冰箱（型号DW-86l626，青岛海尔公司），恒温振荡器（型号HZQF160A，上海一恒科学仪器有限公司）。

2 实验方法

2.1 造模

随机选取40只大鼠，3%戊巴比妥钠1 mL/kg腹腔注射麻醉，将大鼠垂直悬挂在自制固定板上，用眼科镊将大鼠舌尖拉出，并用手电筒与大鼠颈部保持90°照射，观察大鼠咽喉，可以观察到声门开合，缓慢行气管插管，注入博来霉素5 mg/kg[12]。将适量棉花悬空放在大鼠口腔上方，棉花轻轻扬起，证明药液进入肺部，随即将大鼠直立轻轻摇晃1～2 min，使其分布均匀。

2.2 分组及给药

造模后将大鼠随机分为模型组、醋酸泼尼松组和益气养阴活血方高、中、低剂量组（中药高、中、低剂量组），每组8只，另取8只未造模大鼠作为空白组。造模次日开始给药，给药剂量参照人与大鼠体表面积转换系数0.018及成人常规服用剂量换算[13]，中药高、中、低剂量组分别予19.8、9.9、4.95 g/kg益气养阴活血方混悬液灌胃，醋酸泼尼松组予4 mg/kg醋酸泼尼松药液灌胃，灌胃体积1 mL/100 g，连续28 d。空白组和模型组予等体积生理盐水灌胃。

2.3 肺功能检测及取材

末次给药后进行肺功能检测并取材。将大鼠放入体积描记箱，扣盖封闭，待大鼠完全安静且呼吸平稳后，记录5～8 min连续且规律的呼吸波，指标包括吸气时间、呼气时间、每分钟通气量和呼吸频率。以3%戊巴比妥钠1 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，打开腹腔，取出肺脏，右肺组织放入多聚甲醛中固定，用于制作石蜡切片，其余肺组织置于-80 ℃冻存，用于后续实验。

2.4 HE和Masson染色

将多聚甲醛固定的右肺组织制作石蜡切片，切片脱蜡至水，自来水洗。一部分切片用HE染色试剂盒染色5 min，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗，依次放入85%、95%乙醇梯度脱水5 min，脱水，透明，封片；另一部分用Masson染色试剂盒染色，自来水洗后1%冰醋酸漂洗分化，中性树胶封片。显微镜下观察，采集图像进行分析。

2.5 免疫组化染色

石蜡切片脱蜡、水化，置于柠檬酸抗原修复缓冲液（pH 6.0）中修复25 min，放入3%双氧水溶液中阻断内源性过氧化物酶，血清封闭30 min，滴加FN、LN一抗（1∶300），4 °C孵育过夜，切片甩干后滴加相应HRP标记二抗，室温孵育50 min，DAB显色液显色，复染细胞核，脱水封片，显微镜下观察，图像采集分析。以棕色或棕黄色颗粒为阳性表达，计算阳性表达积分光密度（IOD）。

2.6 RT-PCR检测

用TriQuick Reagent总RNA提取试剂盒提取肺组织RNA，使用分光光度计测定RNA浓度及纯度，根据试剂盒说明书进行反转录。反应条件：25 ℃、5 min，55 ℃、15 min，85 ℃、5 min。使用实时荧光定量PCR系统进行反应。反应条件：预变性（95 ℃、2 min）；变性（95 ℃、10 s），退火/延伸（60 ℃、30 s），共40个循环。2-ΔΔCt法计算mRNA 相对表达量。引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.7 Western blot检测

肺组织加入含1%磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上匀浆5 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液，经BCA试剂盒蛋白定量，取上清液并与上样缓冲液混合，金属浴中煮沸10 min，通过SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜，用5%BSA封闭2 h，加一抗（TGF-β1 1∶1 000、Smad3 1∶1 500、p-Smad3 1∶1 000、MMP9 1∶1 000、TIMP1 1∶1 500），4 ℃孵育过夜。TBST洗膜4次，每次10 min，加二抗（1∶7 000），室温孵育2 h，ECL发光液显影，凝胶成像分析系统成像，Image J软件分析蛋白条带灰度值。

3 统计学方法

4 结果

4.1 益气养阴活血方对模型大鼠肺功能的影响

与空白组比较，模型组大鼠吸气时间和呼气时间显著缩短，每分钟通气量和呼吸频率显著增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，醋酸泼尼松组和中药高、中剂量组吸气时间和呼气时间显著延长，每分钟通气量和呼吸频率显著减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠肺功能指标比较（±s）

注：与空白组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01

呼吸频率/bpm 94.77± 2.55 300.75±28.06##143.36±12.97**181.77±12.36**216.41±13.91**291.27±44.27组别空白组模型组醋酸泼尼松组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组只数666666吸气时间/ms 259.19±7.50 95.47±8.25##190.91±7.38**155.00±8.59**136.33±3.66**101.08±9.92呼气时间/ms 387.08±25.69 124.66±16.82##289.30±24.57**219.05±34.97**191.91±13.55**148.77±29.56每分钟通气量/mL 126.34± 6.00 583.27±55.61##212.77±25.51**292.44±17.14**388.44±23.83**547.01±63.81

4.2 益气养阴活血方对模型大鼠肺组织形态的影响

HE染色结果显示，空白组大鼠肺组织结构完整，肺泡间隔窄，肺泡腔无充血及水肿，肺间质无炎性细胞浸润，未见明显病理改变；模型组大鼠肺组织结构损伤明显，肺泡明显塌陷、萎缩，肺泡间隔加宽，出现肺实变及大量炎性细胞浸润；与模型组比较，醋酸泼尼松组和中药各剂量组大鼠肺组织损伤均有所改善，肺泡形态较完整，间隔变窄，炎性细胞浸润减少，以中药高剂量组最为明显。

Masson染色结果显示，空白组大鼠肺间质及支气管周围有少量蓝色胶原纤维；模型组大鼠肺组织支气管管壁增厚、结构破坏，有大量蓝色胶原纤维沉积，且大量成纤维细胞增生，呈肺纤维化病理表现；与模型组比较，醋酸泼尼松组和中药各剂量组大鼠肺组织胶原纤维沉积有不同程度减少，以中药高剂量组最为明显。见图1。

4.3 益气养阴活血方对模型大鼠肺组织纤连蛋白和层粘连蛋白表达的影响

FN染色为棕色，主要在肺泡间隔和肺间质表达；LN染色为棕色或深棕色，在肺实质、纤维间隔及支气管和血管基底膜均有表达。与空白组比较，模型组肺组织FN和LN表达显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，中药高剂量组和醋酸泼尼松组肺组织FN和LN表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。见图2、表3。

图2 各组大鼠肺组织FN和LN阳性表达（免疫组化染色，×200）

表3 各组大鼠肺组织FN和LN表达比较（±s，IOD）

表3 各组大鼠肺组织FN和LN表达比较（±s，IOD）

注：与空白组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

LN 14.14±2.43 37.79±1.75##22.35±3.34**28.20±2.66**29.66±1.47*36.58±1.64组别空白组模型组醋酸泼尼松组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组只数333333 FN 11.34±2.56 34.00±5.08##18.04±1.91**22.85±3.29*28.72±2.36 33.33±5.62

4.4 益气养阴活血方对模型大鼠肺组织TGF-β1、Smad3、MMP9和TIMP1 mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠肺组织TGF-β1、Smad3、MMP9 mRNA表达显著升高（P＜0.01），TIMP1 mRNA表达显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，中药高剂量组和醋酸泼尼松组大鼠肺组织TGF-β1、Smad3、MMP9 mRNA表达显著降低（P＜0.01，P＜0.05），中药各剂量组TIMP1 mRNA表达显著升高（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad3、MMP9、TIMP1 mRNA表达比较（±s，相对表达量）

表4 各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad3、MMP9、TIMP1 mRNA表达比较（±s，相对表达量）

注：与空白组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别空白组模型组醋酸泼尼松组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组TIMP1 1.64±0.11 1.00±0.00##1.52±0.20**1.36±0.07*1.24±0.05*1.22±0.04*只数333333 TGF-β1 0.53±0.02 1.00±0.00##0.78±0.03**0.86±0.03**0.92±0.02*0.94±0.03*Smad3 0.60±0.03 1.00±0.00##0.73±0.02**0.85±0.02**0.90±0.02*0.93±0.06*MMP9 0.69±0.03 1.00±0.00##0.84±0.04**0.91±0.03*0.95±0.01 0.98±0.04

4.5 益气养阴活血方对模型大鼠肺组织TGF-β1、Smad3、p-Smad3、MMP9和TIMP1蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠肺组织TGF-β1、p-Smad3、MMP9 蛋白表达显著升高（P＜0.01），TIMP1蛋白表达显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，中药各剂量组和醋酸泼尼松组大鼠肺组织TGF-β1、p-Smad3、MMP9 蛋白表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01），中药高、中剂量组和醋酸泼尼松组TIMP1蛋白表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。见图3、表5。

图3 各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad3、p-Smad3、MMP9和TIMP1蛋白免疫印迹

表5 各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad3、p-Smad3、MMP9、TIMP1蛋白表达比较（±s）

表5 各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad3、p-Smad3、MMP9、TIMP1蛋白表达比较（±s）

注：与空白组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别空白组模型组醋酸泼尼松组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组TIMP1/GAPDH 1.05±0.04 0.69±0.04##0.98±0.02**0.93±0.02**0.77±0.01*0.71±0.06只数333333 TGF-β1/GAPDH 0.30±0.03 0.81±0.10##0.41±0.11**0.48±0.10*0.55±0.09*0.59±0.10*p-Smad3/Smad3 0.55±0.05 0.91±0.03##0.58±0.04**0.63±0.03**0.70±0.08*0.71±0.09*MMP9/GAPDH 0.53±0.01 1.16±0.04##0.55±0.01**0.76±0.02**0.85±0.03**0.87±0.05**

5 讨论

根据PF 临床症状，可将其归属中医学“肺痹”“肺痿”“肺胀”范畴。《中藏经》曰：“痹者，风寒暑湿之气中于人脏腑之为也……入于肺，则名气痹……气痹者，愁忧思喜怒过多，则气结于上，久而不消则伤肺，肺伤则生气渐衰，则邪气愈胜。”说明肺脏易感受外邪，导致肺宣降不利，气机不畅，即肺痹病机在于气。肺主气血津液运化，肺气推动津液运行，当肺气受损，津液停留于肺，积聚成痰，导致津液代谢失常；阴火袭肺，耗津灼液，易导致肺叶枯萎。气为血之帅，气行则血行，气滞则血瘀。气推动血液在脉络中正常运行，肺气虚则无力助心行血，致血液运行不畅，进而转为血瘀。故气虚、阴亏、血瘀是PF的病理产物及致病因素，三者相互影响，参与PF全过程。益气养阴活血方中黄芪补气生血，当归补血活血，二者合用，增补血之功，且散有形之邪，为君药；麦冬养阴生津，五味子敛肺滋肾、收涩津液，熟地黄补血滋阴，三者共为臣药，辅佐君药扶正祛邪，又养阴生津，助肺恢复通调水道功能；枸杞子滋肾润肺，助当归滋阴养血，又能精血并补，人参补气健脾，佐黄芪补气血，契合肺纤维化病机。

PF主要特征是过度的基质沉积破坏肺实质结构，并造成肺功能障碍[14]。博来霉素诱导PF模型是研究该病最常用的方法[15-16]，在造模后7～14 d，炎症反应逐渐消退，出现纤维增生和胶原沉积增加。本实验HE和Masson染色观察到模型组大鼠肺组织损伤明显，肺泡塌陷、萎缩、间隔加宽，大量炎性细胞浸润及胶原纤维沉积。在肺功能检测中，模型组大鼠呼吸频率明显加快，每分钟通气量增加，可能与肺泡间隔增厚、肺泡腔缩小有关。各给药组能不同程度改善PF大鼠肺组织病理损伤，增加每分钟通气量，降低呼吸频率，使肺泡充分扩张，改善通气功能，以中药高剂量组最为明显。

TGF-β1/Smad信号通路主要通过诱导细胞分化、迁移、侵袭等参与PF 发病过程[17]。PF 小鼠肺组织TGF-β1表达显著升高，抑制TGF-β1表达可改善模型小鼠肺纤维化，延缓PF进展[18]；PF患者气道上皮细胞和成纤维细胞TGF-β1含量增加，造成肺组织异常损伤，从而加速PF进程[19]。本实验Western blot和PCR检测发现，模型组大鼠肺组织TGF-β1、p-Smad3呈高表达，益气养阴活血方可显著抑制TGF-β1、p-Smad3表达。MMP作为降解细胞外基质的最大酶群，其活性可被TIMP抑制。正常生理条件下，MMP和TIMP处于动态平衡，当TIMP表达升高时，细胞外基质降解减少，导致肺间质细胞外基质过度沉积，促使PF 发生[20]。MMP高表达会破坏肺组织基底膜及肺结构，使肺泡腔塌陷，加重肺部损伤，进一步促进TGF-β1释放，TGF-β1 作为MMP 活化与合成的促进剂，导致MMP表达进一步升高，由此形成恶性循环[21]。本实验结果显示，模型组MMP9 表达较空白组明显升高，TIMP1表达明显降低，益气养阴活血方能下调模型大鼠肺组织MMP9表达、上调TIMP1表达。免疫组化染色观察细胞外基质成分FN 和LN 表达发现，模型组FN、LN表达均升高，益气养阴活血方能降低FN和LN表达，提示益气养阴活血方通过维持细胞外基质成分的合成与降解改善肺结构。综上，益气养阴活血方能通过抑制TGF-β1、p-Smad3 表达，调节MMP9/TIMP1平衡，降解细胞外基质，延缓PF发展。本研究初步探讨益气养阴活血方改善PF的作用机制，今后将继续深入探索该方发挥作用的具体药效成分及其他潜在靶点，为临床治疗PF提供新思路。