降解聚乙烯真菌哈茨木霉（Trichodermaharzianum）的筛选和鉴定

曹萌萌 朱利霞 桑成琛 栗婷轩 张艳君

摘  要：从长期覆膜农田土壤中筛选出一种能够降解聚乙烯的菌株——哈茨木霉（Trichoderma harzianum）.将筛选出的哈茨木霉接种到以聚乙烯为唯一碳源的培养基中培育30天，聚乙烯失重率约为10%，聚乙烯薄膜表面出现明显的孔洞和裂痕.

关键词：聚乙烯；地膜；哈茨木霉；降解

[   中图分类号    ]X172[    文献标志码   ]  A

Screening and Identification of Polyethylene-degrading Fungus Trichoderma harzianum

CAO Mengmeng，ZHU Lixia*，SANG Chengchen，LI Tingxuan，ZHANG Yanjun

（College of Life Science and Agronomy，Zhoukou Normal University，Zhoukou 466001，China）

Abstract：A Trichoderma harzianum strain capable of degrading polyethylene was isolated from soil collected from a field with long-term plastic film mulching.After the fungus was isolated，Trichoderma harzianum was incubated for 30 days in a liquid medium with polyethylene film as the sole carbon source.The results showed that the weight loss of polyethylene film was about 10% after the incubation，obvious erosion holes and cracks appeared on the surface of degraded polyethylene film.

Key words：polyethylene；plastic film；Trichoderma harzianum；degradation

聚乙烯地膜殘留在土壤中严重影响土壤生态环境和农业的可持续发展，为了实现环保高效降解聚乙烯残膜，亟需筛选可降解聚乙烯的微生物.地膜是我国农业生产中常用的生产资料之一，自地膜覆盖技术被引入到我国后，农业生产中地膜的用量逐年增长，我国成为全球地膜覆盖面积最大的国家.聚乙烯是一种稳定性好、抗腐蚀性强的高分子聚合物，是农业地膜最常用的塑料.[1]聚乙烯地膜可以改善土壤水热状况，提高作物产量，然而当季作物收获后，聚乙烯地膜常常由于风化破败而无法继续使用，导致大量聚乙烯地膜残留在土壤中，造成白色污染[2] ，导致土壤生产力的降低和生态环境的破坏，影响农业的可持续发展.目前解决聚乙烯残膜污染的方法主要是焚烧、填埋、回收利用等.聚乙烯农用地膜厚度过薄，回收成本较高，焚烧和填埋成为处理聚乙烯残膜的主要方法，而焚烧和填埋聚乙烯残膜又会造成严重的二次污染.[3]探寻清洁高效的聚乙烯残膜降解途径，解决由聚乙烯残膜引起的环境问题至关重要.微生物生长繁殖速度快，代谢旺盛，代谢类型多，是一种有效降解聚乙烯的途径.[4]对单一菌种的降解效果研究表明，真菌的菌丝可以更好地附着在聚乙烯残膜的表面并能穿透残膜，其降解效果远远优于细菌.[5]因此，真菌在缓解聚乙烯残膜造成的环境问题方面具有更大的潜力.[6]本研究从长期覆盖地膜的农田土壤中分离出一株能有效降解聚乙烯塑料的真菌.

1 材料和方法

1.1 供试材料

2021年11月，采集周口市川汇区农田的土壤，该农田从2009年以来长期种植蔬菜并覆盖聚乙烯地膜，土壤中残留大量聚乙烯薄膜.

试验所用聚乙烯为农贸市场购置的农用地膜，在实验开始前将其剪成4 cm×4 cm的方块形，依次用1%十二烷基硫酸钠溶液、95%乙醇和75%乙醇浸泡并灭菌，在超净工作台中风干，备用.

培养基为液体无机盐培养基和固体无机盐培养基.固体无机盐培养基由液体无机盐培养基添加1.8%的琼脂制得.马铃薯葡萄糖培养基（PDA）由马铃薯、葡萄糖、琼脂制成，pH值自然.

1.2 聚乙烯降解菌的分离纯化

将采集的土壤样品5 g加入45 mL无菌生理盐水中，150 r/min振荡30 min，制得土壤稀释液.移取20 μL土壤稀释液于100 mL以1%聚乙烯为唯一碳源的无机盐培养基中，用于分离以聚乙烯为唯一碳源的菌株.移取20 μL土壤稀释液于100 mL不添加聚乙烯的无机盐培养基中作为对照.将接种过的培养基置于28 ℃恒温培养箱中，振荡（150 r/min）培养10天.弃去聚乙烯膜，将所得培养液用无菌生理盐水梯度稀释后取稀释液0.2 mL，涂布法接种于马铃薯葡萄糖培养基上培养，采用平板划线法进行多次转接，获得菌株的纯培养.

将得到的菌株以涂布法接种到铺有4 cm×4 cm聚乙烯的固体无机盐培养基上，置于28 ℃恒温培养箱中，观察聚乙烯膜片周围菌落的形成情况，筛选出具有潜在降解聚乙烯能力的菌株.

1.3 聚乙烯降解菌的鉴定

形态学鉴定 参考杨合同[7]等的分类方法，对PDA培养皿上的菌落形态进行观察对比，初步判定其分类地位.

分子生物学鉴定[8-9]  将筛选到的菌株采用生工生物工程（上海）有限公司柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取总DNA，测定ITS序列.采用ITS通用引物ITS1 （5′-TCCGTACCTGAACCTGCGG-3′）和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将检测合格的PCR产物送至北京诺禾致源科技股份有限公司测序.测序结果用Bioedit软件分析，截取可信度较高的序列，使用NCBI-BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）将截取序列与数据库中的序列进行比对分析，根据ITS序列的相似度鉴定菌株. 采用邻接法用MEGA 7.0构建系统发育树，分析菌株之间的亲缘关系.

1.4 聚乙烯降解菌降解效能分析

聚乙烯失重率测定 在无菌条件下将纯化的菌株以5%的接种量接种到含聚乙烯片的液体无机盐培养基中，28 ℃，150 r/min培养30天，分别在第5，10，15，20，25和30天测定聚乙烯片的失重率.用去离子水反复清洗聚乙烯片，去除其表面附着的菌体，并将聚乙烯片置于50 ℃烘箱中干燥过夜，冷却称重.根据培养前后聚乙烯膜片的质量变化计算失重率.

培养基中降解菌生长情况 将菌株PT1的菌悬液按照体积比10%的比例接种到以聚乙烯为唯一碳源的无机盐液体培养基中，聚乙烯薄膜加入量按照1%的质量比加入聚乙烯薄膜，在28 ℃条件下振荡（150 r/min）培养30天，分别记录第5，10，15，20，25和30天液体培养基的光密度值（OD600）.

扫描电镜观察聚乙烯微观形态 将降解30天的聚乙烯薄膜清洗去除其表面附着的菌膜及其他杂质后，自然风干，用扫描电子显微镜观察接种与未接种菌株PT1培养基中聚乙烯薄膜的特征，比较聚乙烯薄膜表面微观形态变化情况.

2 结果和分析

2.1 聚乙烯降解菌的筛选

将接种土壤悬液的无机盐培养基置于28 ℃，150 r/min培养10天后，含有聚乙烯片的培养基明显浑浊，未加聚乙烯片的培养基清澈.采用平板划线法分离纯化获得菌株，将其命名为PT1.

2.2 菌株PT1的鉴定

在28 ℃条件下，聚乙烯降解菌PT1菌株在马铃薯葡萄糖培养基上的菌落气生菌丝呈白色绒毛状，中心部位有产孢簇，初始颜色绿色，之后逐渐加深（图1），这与杨合同[7]等描述的木霉属菌落特征基本一致.初步判定该菌株为木霉属微生物.

将提取的DNA序列扩增后回收测序，序列片段长度为618 bp.将序列提交至NCBI数据库进行核酸序列比对，发现该菌株与哈茨木霉的ITS序列同源性高于99%，从亲缘关系上判定菌株PT1为木霉属哈茨木霉.构建PT1菌株系统发育树（图2），发现菌株PT1与哈茨木霉（Trichoderma harzianum，Genebank ID： AF345950.1）位于同一分支.因此，结合形态学特征和分子生物学特征，判定该聚乙烯降解菌株PT1为哈茨木霉（Trichoderma harzianum）.

2.3 哈茨木霉对聚乙烯的降解效能

在培养过程中，培养基光密度值OD600呈现出先增加后降低的趋势（图3A）.在培养前10天，OD600较小（OD600<0.05），培养液中菌株浓度较低，这可能是菌株适应培养液环境的过程，根据微生物生长发育规律，此时菌株处于延滞期；在10～20天，OD600增加较快，此时哈茨木霉已经适应该环境，菌株大量增长并以聚乙烯为碳源进行生长繁殖，菌株处于快速生长期；在第20～30天，OD600增加缓慢，培养液中菌体数量下降，可能是由于此时培养液中无机盐含量逐渐减少，成为菌株生长的限制因子，且菌株代谢产物的积累抑制其自身的生长繁殖，导致此时菌株生长处于衰亡期.此外，菌株在生长过程中为了利用碳源而大量附着在聚乙烯片表面也可能导致培养液中菌株浓度下降.

比较聚乙烯薄膜在接种哈茨木霉前后的质量损失，评价聚乙烯薄膜的表观降解状况.经过30天的培养后，聚乙烯薄膜失重率约为10%，表明哈茨木霉能够降解聚乙烯（图3B）.

哈茨木霉接种于聚乙烯薄膜为唯一碳源的无机盐培养中30天后，用扫描电镜检测聚乙烯表面微观形态的变化（图4）.聚乙烯片表面结构发生明显的变化，出现孔洞和裂痕，未接种哈茨木霉的聚乙烯片表明光滑，无变化，说明哈茨木霉能够附着在聚乙烯片表面并以聚乙烯为碳源进行生长繁殖，哈茨木霉能够有效降解聚乙烯.

3 讨论

聚乙烯由乙烯单体经过聚合反应形成，是一种高分子聚合物，具有耐用、抗腐蚀的特点，被广泛用于工业和农业领域.农膜的使用使得大量聚乙烯残留在土壤中，影响土壤生态环境和农业可持续发展.本研究从长期覆盖聚乙烯薄膜的土壤中筛选出一株聚乙烯降解真菌——哈茨木霉，该菌株能够降解低密度聚乙烯.哈茨木霉是一种腐生真菌，隶属于盘菌亚门、肉座菌目、肉座菌科、木霉属.哈茨木霉具有降解纤维素的能力，能够分泌促生因子，降解多环芳烃等.[10]已有的降解聚乙烯的真菌主要为曲霉属真菌，也有关于青霉属真菌降解聚乙烯的报道，关于木霉属真菌的报道较少.李夏[11]等分离出一种能够降解聚乙烯农膜的枯青霉，培养100天后，聚乙烯薄膜结构发生明显改变，在该条件下枯青霉对聚乙烯的降解速度較慢.

聚乙烯微生物降解过程是微生物附着、菌丝生长、产酶降解最终被分解为CO2和水的过程.[12]在聚乙烯降解的整个过程中，哈茨木霉菌株处于寡营养条件下，30天后聚乙烯失重率10%左右.微生物在寡营养条件下会启动适应机制以维持自身生长[13]，菌株在聚乙烯无机盐培养基中的生长浓度较高，可能是由于菌株在生长过程中启动了适应机制，缺乏有效碳源的条件下微生物会改变其对碳源的利用偏好[14]，由此，哈茨木霉以聚乙烯为碳源进行生长代谢活动.由于哈茨木霉能够以聚乙烯作为碳源，经过30天的培养后，大量菌丝侵入并穿透聚乙烯薄膜，使得聚乙烯出现明显的破损和孔洞，这直接证明了哈茨木霉能够有效降解聚乙烯.

目前已发现的菌株对聚乙烯等塑料的降解效率较低，具有高效生物降解性能的菌株还很稀少，寻找高效的聚乙烯降解微生物和酶系统，丰富降解菌种资源库的研究亟待加强.Khan[15]等发现在基础无机盐培养基中额外添加2%葡萄糖，可大大提高宾曲霉对塑料地膜的降解能力.此外，在利用微生物降解塑料制品试验中，可以通过调节pH值、控制培养温度、添加金属离子及其他化学物质等改善菌株对聚乙烯等塑料的降解效果，挖掘其降解潜能.由于微生物在降解聚乙烯过程中会分泌相应的降解酶（如水解酶、氧化还原酶），这就使得了解降解酶及其产生过程显得更为重要.因此，在今后的研究中，我们将从哈茨木霉在降解聚乙烯过程中产生降解酶及调控降解酶产生的基因入手，深入了解哈茨木霉降解聚乙烯的机制，挖掘其在降解聚乙烯方面的潜能，为农业可持续发展提供科学依据.

4 结论

从长期覆膜的农田土壤中分离筛选出1株能够有效降解聚乙烯塑料的菌株，通过形态学特征和ITS序列同源性比对，初步鉴定该菌株为木霉属哈茨木霉.通过失重法、培养液光密度值和表面微观形态等方法验证了该菌株能够有效降解聚乙烯.本研究中筛选出的菌株尚未进行降解条件的优化及其降解机制的研究，后期我们将探究如何提高该菌株对聚乙烯的降解效能，以期为农田聚乙烯残膜的高效环保降解提供参考.

參考文献

[1]Qi R M，Jones D L，Li Z，et al.Behavior of microplastics and plastic film residues in the soil environment： A critical review[J].Science of The Total Environment，2020，703： 134722.

[2]Geyer R，Jambeck J R，Law K L.Production，use，and fate of all plastics ever made[J].Science Advances，2017，3（7）： e1700782.

[3]陈雷，姜玉，龚斌，等．可生物降解塑料与沸石载体体系对硝酸盐氮污染地下水的生物修复研究[J]．环境污染与防治，2017，39（4）：345-351，355．

[4]李鹏飞，侯德义，王刘炜，等.农田中的（微）塑料污染：来源、迁移、环境生态效应及防治措施[J].土壤学报，2021，58（2）：314-330．

[5]Shen M C，Song B，Zeng G M，et al.Are biodegradable plastics a promising solution to solve the global plastic pollution[J].Environmental Pollution，2020，263： 114469.

[6]Sánchez C.Fungal potential for the degradation of petroleum-based polymers： An overview of macro- and microplastics biodegradation[J].Biotechnology Advances，2020，40： 107501.

[7]杨合同，唐文华，徐砚珂，等.木霉菌属的定义及其属下分类[J].山东科学，2002，15（2）：15-22．

[8]穆燕，律凤霞，艾鑫，等.野生蜜环菌（Armillaria Mellea）的分离纯化及抑菌作用[J].牡丹江师范学院学报：自然科学版，2022（2）：62-64．

[9]赵世明，律凤霞.番茄早疫病病原菌分离纯化及分子鉴定[J].牡丹江师范学院学报：自然科学版，2020（4）：31-34．

[10]Zhang F G，Zhou Z B，Xiao Y.Trichoderma biofertilizer facilitating Leymus chinensis production in different growth stages is strongly linked to dynamically altered soil microbiomes[J].Agriculture，Ecosystems and Environment，2022，324：107706.

[11]李夏，顾文杰，杨少海，等.一株地膜降解真菌的筛选及其降解性能分析[J].微生物学报，2019，59（1）：56-67．

[12]Kim M Y，Kim C，Moon J，et al.Polymer film-based screening and isolation of polylactic acid （PLA）-degrading microorganisms[J].Journal of Microbiology and Biotechnology，2017，27（2）： 342-349.

[13]钟越，李雨竹，张榕麟，等.一株聚乙烯降解菌的筛选及其降解特性研究[J].生态环境学报，2017，26（4）：681-686．

[14]翁晓虹，隋心，李梦莎，等.模拟氮沉降对三江平原小叶章湿地土壤微生物碳源利用能力的影响[J].环境科学，2022，43（9）：4674-4683.

[15]Khan S，Nadir S，Shah Z U，et al.Biodegradation of polyester polyurethane by Aspergillus tubingensis[J].Environmental Pollution，2017，225： 469-480.

编辑：琳莉