首诊干眼患者结膜黏蛋白表达变化及临床意义

欧阳维杰 刘祖国 孙旭光 邓应平 李青松 黄彩虹 林祥 朱莉

1厦门大学附属厦门眼科中心 厦门大学附属翔安医院 厦门大学眼科研究所 福建省眼科与视觉科学重点实验室,厦门 361102;2首都医科大学附属北京同仁医院眼科,北京 100069;3四川大学华西医院眼科,成都 610044;4上海市普陀区中心医院眼科,上海 200062

干眼是一种多因素引起的慢性眼表疾病,患者可出现眼干、异物感等一系列眼部不适症状,严重影响患者的生活质量[1]。泪膜不稳定是干眼发生的核心机制[2-3]。眼表组织中的黏蛋白分为跨膜型和分泌型黏蛋白,主要由结膜、角膜及泪腺所分泌,其质或量的异常可导致泪膜稳定性下降,泪液无法停留在眼表,引发干眼[4-5],进而引起眼表上皮细胞损伤,加重黏蛋白的异常。因此,关注眼表黏蛋白的变化是干眼研究中的一个重要领域。已有多项研究对干眼患者眼表黏蛋白含量的变化进行检测,但研究报道的结果有所不同。部分研究发现干眼患者眼表杯状细胞数量减少,MUC5AC蛋白水平下降[6-8],结膜上皮中MUC1、MUC4及MUC16表达量下降[9-10],而另有研究发现在干燥综合征及非干燥综合征患者的眼表及泪液中MUC1和MUC16表达量增加[11-13]。最新版的国际泪膜和眼表协会干眼疾病工作组第二次会议制定的国际干眼指南虽然对所有研究结果进行了全面总结,但仍无法准确对干眼患者眼表组织中黏蛋白的变化进行定论[14]。本研究拟探讨干眼患者结膜组织中黏蛋白表达量变化及其与干眼症状和体征之间的关联,为干眼防控和治疗措施的制定提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用横断面研究方法,纳入2016年12月至2018年5月在厦门大学附属厦门眼科中心(27例)、首都医科大学附属北京同仁医院(20例)、四川大学华西医院(3例)、上海市普陀区中心医院(19例)首次就诊、未曾接受干眼相关药物干预的干眼患者69例69眼作为干眼组,各分中心干眼诊断均依据《干眼临床诊疗专家共识(2013年)》标准[5],同期纳入健康志愿者40人40眼作为正常对照组。干眼组患者平均年龄(39.7±13.3)岁,正常对照组平均年龄(22.2±2.8)岁。干眼组患者MUC1、MUC4、MUC5AC和MUC16表达量与年龄无明显相关性(rs=-0.065,P=0.598;rs=-0.014,P=0.911;rs=-0.247,P=0.081;rs=-0.029,P=0.815)。干眼组男女比例为1∶2,正常对照组为7∶3。干眼组男和女MUC1 mRNA相对表达量分别为2.96(0.80,4.05)、2.39(0.01,5.67),MUC4 mRNA相对表达量分别为2.02(0.91,3.96)、2.50(1.09,4.90),MUC5AC mRNA相对表达量分别为0.21(0.02,1.13)、0.06(0.02,3.41),MUC16 mRNA相对表达量分别为2.20(1.20,3.80)、1.67(0.99,3.62),不同性别间各黏蛋白表达量比较差异均无统计学意义(Z=522.0,P=0.94;Z=486.5,P=0.69;Z=184.0,P=0.84;Z=457.5,P=0.37)。其中来自北京的患者MUC1 mRNA相对表达量较其他地区低(Z=35.78,P=0.0001),来自厦门的患者泪液分泌量和泪膜破裂时间(tear breakup time,TBUT)较其他地区低(Z=20.68,P=0.0001;Z=19.91,P=0.0001)。考虑到病例数量较少,可能会产生偏倚,故暂不对3例四川地区的患者与其他地区的患者结果进行比较。

干眼患者纳入标准:(1)年满18周岁;(2)首次门诊就诊患者;(3)症状和体征符合中国干眼诊断标准[5]。排除标准:(1)已诊断为干眼且接受过治疗的患者;(2)对荧光素钠溶液有变态反应史者;(3)有除干眼外的其他眼部疾病者或接受过任何眼部手术者;(4)有眼部用药史者;(5)有全身疾病史或全身用药史者;(6)主要研究者和/或协助研究者认为不适合参加此项研究的患者。纳入研究的患者双眼均接受检查,选择干眼症状评分高的一侧眼作为研究眼;若双眼干眼评分相等,则纳入角膜荧光素钠染色较重的一侧眼;若双眼荧光素钠染色程度相等则取右眼为研究眼。

正常受检者入组标准:(1)年满18周岁;(2)不存在任何需接受治疗的眼科疾病;(3)至少有一侧眼符合以下标准:①未出现干眼症状;②TBUT>5 s;③无麻醉Schirmer试验Ⅰ结果>5 mm/5 min;④角膜无荧光素钠染色。排除标准:(1)诊断为干眼或存在疑似干眼症状或体征者;(2)既往有眼科疾病史者;(3)有荧光素钠变态反应史者;(4)主要研究者和/或协助研究者认为不适合参加此项研究者。纳入研究的正常受检者双眼均接受相应检查,若双眼均符合入组标准则以右眼为研究眼。本试验方案分别经厦门大学附属厦门眼科中心、首都医科大学附属北京同仁医院、四川大学华西医院、上海市普陀区中心医院伦理委员会批准[批文号:2017003、TREC2016-29、2016年审(310)号、PTEC-A-2016-18-1],研究过程遵循《赫尔辛基宣言》和中国有关临床试验研究规范和法规,患者进入研究前均了解本研究的方法和目的并自愿签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1质量控制 4家眼科中心研究人员在项目启动前进行统一培训,规范检查设备,统一检查和干眼诊断标准,检查人员具有药物临床试验质量管理规范培训证书。试验全程由临床协调员监察临床研究质量、跟踪研究进度及临床试验工作协调。

1.2.2眼科临床检查 对所有受检者进行临床检查,包括记录患者病史、干眼症状评分、TBUT、角膜结膜荧光素钠染色评分、Schirmer试验Ⅰ。本研究按照如下顺序依次对受试者进行检查。

1.2.2.1干眼症状评分 先后采用中国干眼问卷、眼表疾病指数量表(Ocular Surface Disease Index,OSDI)和干眼相关生活质量评分问卷(Dry Eye-Related Quality-of-Life Score Questionnaire,DEQS)对受检者进行干眼症状评估,所有受检者在研究者的监督和指导下独立填写并完成3份问卷。根据OSDI问卷症状评分[17]将干眼组受检眼进行症状分组:总分≤12为无症状组,共9眼;总分>12～32为轻中度症状组,共40眼;总分>32为重度症状组,共20眼。

1.2.2.2TBUT测定 将用1滴生理盐水湿润的荧光素钠试纸条接触受检者下睑结膜囊,嘱受检者瞬目数次,使试纸条与泪液充分混合。采用16倍裂隙灯显微镜(SL220,德国蔡司公司)的钴蓝光观察受检者末次瞬目至出现第1个泪膜破裂点的时间,TBUT<5 s为异常。检查重复3次,取平均值。

1.2.2.3荧光素钠染色评估角结膜上皮完整性 TBUT测定结束后继续在16倍裂隙灯显微镜钴蓝光下观察角结膜荧光素染色。根据国际眼科机构染色分级标准[15]对角膜上皮完整性进行评估。将角膜分为上、鼻、中、下、颞侧5个区域,每个区域评分均为0～3分,总分为各区域评分之和,总分≥1分为异常。参照Van Bijsterveld评分体系[16]对角结膜上皮完整性进行评分。将角结膜分为颞侧、角膜和鼻侧3个区域,每个区域评分0～3分,总分为各区评分之和,总分≥1分为异常。

1.2.2.4Schirmer试验Ⅰ评估泪液分泌量 在无局部麻醉情况下,将Schirmer试纸弯折处放入患者下睑结膜囊中外1/3处,嘱患者平视前方后闭眼,5 min后取出试纸条,测量泪液浸润长度。泪液浸润长度≤5 mm为异常。

1.2.2.5干眼症状体征评估 在干眼症状方面,OSDI评分≤32分为轻中度干眼,>32分为重度干眼。在体征方面,根据有无角膜荧光素钠染色将干眼分为轻度和重度干眼。

1.2.3结膜印迹细胞学标本采集 采用盐酸丙美卡因滴眼液点眼行表面麻醉,嘱患者注视下方,暴露受检眼上方球结膜,并用无齿镊夹取醋酸纤维素膜轻贴于患者上方球结膜,在膜上均匀轻压数次,3～5 s后取下醋酸纤维素膜,并用另一无齿镊将膜放入350 μl保存液中(裂解液:β-巯基乙醇体积比为100∶1),漩涡振荡1 min,使细胞充分裂解,-80 ℃保存。操作结束后受检眼用氧氟沙星滴眼液点眼。

1.2.4实时荧光定量PCR法测定标本中MUC1、MUC4、MUC5AC及MUC16 mRNA相对表达量 根据RNA提取试剂盒[DP420,天根生化科技(北京)有限公司]操作步骤,将-80 ℃保存的标本室温下溶解,涡旋振荡混匀,转移至过滤柱CS上,离心半径10 cm,12 000 r/min离心2 min,收集滤液,加入1倍体积分数70%乙醇,用移液器混匀,全部转移至吸附柱CR1上,12 000 r/min离心30～60 s,弃废液。向吸附柱中加入350 μl去蛋白液RW1,12 000 r/min离心30～60 s,弃废液。向吸附柱中加入80 μl DNase I工作液,室温下放置15 min,加入350 μl去蛋白液RW1,12 000 r/min离心30～60 s,弃废液。向吸附柱中加入500 μl漂洗液RW,室温静置2 min,12 000 r/min离心30～60 s,弃废液,重复漂洗2次。12 000 r/min离心2 min,弃废液。将吸附柱在室温下放置数分钟,以彻底晾干残余的漂洗液。将吸附柱置入新的RNase-free离心管中,加入14 μl RNase-free ddH2O,室温放置2 min,12 000 r/min离心1 min,所得溶液即为RNA溶液。采用RNA逆转录试剂盒(KIT0204,美国Thermo Fisher Scientific公司)进行逆转录,得到cDNA。采用SYBR预混试剂盒(RR420A,日本TaKaRa公司),反应体系为10.0 μl,包括1.0 μl cDNA,0.2 μl正向和反向引物,5.0 μl混合液及3.6 μl DEPC水。PCR反应条件:95 ℃变性10 s,60 ℃退火5 s,72 ℃延伸20 s,共45个循环。引物序列(5'-3'):MUC1正向序列为ACAATTGACTCTGGCCTTCC,反向序列为CAGACTGG GCAGAGAAAGGA;MUC4正向序列为CTTACTCTGGC CAACTCTGTAGTG,反向序列为GAGAAGTTGGGCTTG ACTGTC;MUC5AC正向序列为TCCACCATATACCGC CACAGA,反向序列为TGGACCGACAGTCACTGTCAAC;MUC16正向序列为GCCTCTACCTTAACGGTTACAATG AA,反向序列为GGTACCCCATGGCTGTTGTG;β-actin正向序列为CATGTACGTTGCTATCCAGGC,反向序列为CTCCTTAATGTCACGCACGAT。以β-actin为内参,采用2-ΔCt计算各目的黏蛋白基因相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析。计量资料采用Shapiro-Wilk检验法行正态分布检验,均不满足正态分布,以M(Q1,Q3)表达。2个组间相关评估指标差异比较采用Wilcoxon秩和检验,多个组间评估指标总体差异比较采用Kruskal-WallisH检验,多重比较采用Nemenyi检验。采用Spearman秩相关分析法评估干眼患者结膜黏蛋白表达水平与受检眼症状评分及体征相关指标间的关联性。P<0.05为差异有统计学有意义。

2 结果

2.1 干眼组和正常对照组受检者结膜中MUC1、MUC4、MUC5AC及MUC16 mRNA相对表达量比较

干眼组受检眼结膜中跨膜黏蛋白MUC1和MUC16 mRNA相对表达量分别为3.277(0.568,5.790)和1.815(1.048,3.694),分别高于正常对照组的1.055(0.550,2.010)和1.024(0.541,1.965),差异均有统计学意义(Z=819.00,P=0.008;Z=861.00,P=0.002);干眼组受检眼结膜中MUC4 mRNA相对表达量为2.465(1.016,4.881),高于正常对照组的1.356(0.371,3.082),差异无统计学意义(Z=1 029.00,P=0.055)。干眼组受检眼结膜中MUC5AC mRNA相对表达量为0.075(0.022,1.725),与正常对照组的0.288(0.075,2.325)比较差异无统计学意义(Z=438.00,P=0.226)(图1)。

图1 各组受检眼结膜中MUC1、MUC4、MUC5AC和MUC16 mRNA相对表达量比较 与正常对照组比较,aP<0.05(Wilcoxon秩和检验,正常对照组n=40,干眼组n=69)

2.2 干眼组和正常对照组受检眼临床症状评分比较

干眼组TBUT和平均泪液分泌量明显小于正常对照组,角膜染色评分、角结膜染色评分、中国干眼问卷评分、OSDI评分以及DEQS评分均高于正常对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)(表1)。干眼患者中,症状轻体征轻者28例、症状重体征轻者10例、症状轻体征重者21例、症状重体征重者10例。

2.3 各组受检眼结膜中MUC1、MUC4、MUC5AC及MUC16 mRNA表达量与干眼症状评分的关联

干眼组中结膜MUC1、MUC4、MUC5AC和MUC16 mRNA相对表达量与中国干眼问卷、OSDI和DEQS总评分间均无明显相关性(均P>0.05)。无症状组、轻中度症状组和重度症状组受检眼结膜中MUC1 mRNA相对表达量分别为3.209(0.157,5.666)、3.277(1.161,6.226)和0.859(0.015,4.472),轻中度症状组结膜中MUC1 mRNA表达量明显高于正常对照组,差异有统计学意义(Z=9.04,P=0.029)。重度症状组MUC16 mRNA相对表达量明显高于正常对照组,差异有统计学意义(Z=12.24,P=0.007)。各不同症状评分组间MUC4、MUC5AC mRNA相对表达量比较,差异均无统计学意义(Z=4.69,P=0.196;Z=2.72,P=0.437)(图2)。

图2 不同干眼症状评分组MUC1、MUC4、MUC5AC及MUC16 mRNA表达量比较 与正常对照组比较,aP<0.05(Kruskal-Wallis H检验,正常对照组n=40,无症状组n=9,轻中度症状组n=40,重度症状组n=20) 1:正常对照组;2:无症状组;3:轻中度症状组;4:重度症状组 MUC:黏蛋白

表1 各组受检眼临床症状比较[M(Q1,Q3)]Table 1 Comparison of clinical symptoms between two groups [M(Q1,Q3)]组别眼数TBUT(s)平均泪液分泌量(mm)角膜染色评分(分)角结膜染色评分(分)中国干眼问卷评分(分)OSDI评分(分)DEQS评分(分)正常对照组407.67(5.75,9.33)19.00(9.75,30.00)0.00(0.00,0.00)0.00(0.00,0.00)5.00(3.00,7.00)8.33(4.17,19.17)9.17(3.33,16.25)干眼组693.00(2.33,4.00)9.00(5.00,13.00)0.00(0.00,2.00)0.00(0.00,1.00)10.00(7.00,14.50)22.50(16.67,34.75)23.33(16.67,39.17)Z值147.0614.0827.5960.0487.0522.5535.0P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 注:(Wilcoxon秩和检验) TBUT:泪膜破裂时间;OSDI:眼表疾病指数量表;DEQS:干眼相关生活质量评分问卷 Note:(Wilcoxon rank sum test) TBUT:tear film breakup time;OSDI:Ocular Surface Disease Index;DEQS:Dry Eye-Related Quality-of-Life Score Question-naire

2.4 干眼患者结膜MUC1、MUC4、MUC5AC及MUC16 mRNA相对表达量与干眼体征评分的相关性

干眼患者结膜MUC1 mRNA相对表达量与TBUT呈正相关(rs=0.270,P=0.025),与角膜染色评分呈负相关(rs=-0.331,P=0.006),与角结膜染色评分呈负相关(rs=-0.325,P=0.007),与视频播放终端使用时间呈正相关(rs=0.547,P=0.001)。MUC1、MUC4、MUC5AC及MUC16 mRNA相对表达量与泪液分泌量均不相关(rs=-0.184,P=0.134;rs=0.066,P=0.596;rs=-0.230,P=0.108;rs=-0.117,P=0.343)(表2)。

角膜染色阳性患者中,MUC1 mRNA相对表达量与DEQS中难以睁眼的症状评分呈正相关(rs=0.275,P=0.035),与角膜染色评分、泪液分泌量均呈负相关(rs=-0.331,P=0.006;rs=-0.437,P=0.016)。MUC4表达与眼痛症状评分呈正相关(rs=0.371,P=0.044)。MUC16 mRNA相对表达量与DEQS中视物模糊症状评分呈负相关(rs=-0.359,P=0.047)(表3)。MUC4与MUC16的表达呈正相关(rs=0.455,P=0.012)。在角膜染色阴性患者中,MUC1表达与视频播放终端使用时间呈正相关(rs=0.622,P=0.003),与晨起分泌物出现频率评分呈负相关(rs=-0.498,P=0.001),与MUC16呈正相关(rs=0.635,P<0.001)。MUC4表达与干燥感症状评分呈负相关(rs=-0.393,P=0.015);MUC16与干眼患者生活质量评分,如阅读时症状加重评分、影响开夜车程度评分、影响计算机工作程度评分、影响看电视程度评分均呈负相关(rs=-0.370,P=0.034;rs=-0.558,P=0.016;rs=-0.498,P=0.006;rs=-0.515,P=0.002)(表4)。

表2 结膜黏蛋白与干眼体征评分的相关性Table 2 Correlation between conjunctival mucins and dry eye signs黏蛋白眼数TBUT角膜染色评分VDT时间中国干眼问卷OSDI评分DEQS评分角结膜染色评分rsPrsPrsPrsPrsPrsPrsPMUC1690.2700.025-0.3310.0060.5470.001-0.0830.498-0.1700.8890.0440.717-0.3250.007MUC4690.1350.272-0.1970.108-0.0960.590-0.1970.108-0.1070.383-0.1760.151-0.0220.549MUC16690.2490.0390.1090.373-0.2390.240-0.0100.936-0.0520.672-0.0860.4810.0550.656MUC5AC51-0.0820.5670.0830.5630.0120.943-0.0160.912-0.0320.823-0.0070.963-0.0870.549 注:(Spearman秩相关分析) MUC:黏蛋白;TBUT:泪膜破裂时间;VDT:视频播放终端;OSDI:眼表疾病指数量表;DEQS:干眼相关生活质量评分问卷 Note:(Spearman correlation analysis) MUC:mucin;TBUT:tear breakup time;VDT:video display terminal;OSDI:Ocular Surface Disease Index;DEQS:Dry Eye-Related Quality-of-Life Score Questionnaire

表3 角膜染色阳性患者黏蛋白表达与症状体征评分的相关性Table 3 Correlation between expression levels of conjunctival mucins and symptoms,signs in dry eye patients with positivecorneal fluorescein staining黏蛋白眼数难以睁眼评分(DEQS)角膜染色评分眼痛评分(OSDI)视物模糊评分(DEQS)MUC4泪液分泌量rsPrsPrsPrsPrsPrsPMUC1310.2750.035-0.3310.006-0.3080.0920.1410.451-0.1890.818-0.4370.016MUC430-0.1660.381-0.0060.9760.3710.044-0.0930.624——-0.0370.849MUC16310.3230.0760.1220.5140.2580.162-0.3590.0470.4550.012-0.0680.722 注:(Spearman秩相关分析) MUC:黏蛋白;OSDI:眼表疾病指数量表;DEQS:干眼相关生活质量评分问卷 Note:(Spearman correlation analysis) MUC:mucin;OSDI:Ocular Surface Disease Index;DEQS:Dry Eye-Related Quality-of-Life Score Questionnaire

表4 角膜染色阴性患者黏蛋白表达与症状体征评分的相关性Table 4 Correlation between expression levels of conjunctival mucins and symptoms,signs in dry eye patients with negativecorneal fluorescein staining黏蛋白眼数VDT时间(h/周)晨起分泌物评分(中国干眼问卷)干燥感评分(中国干眼问卷)阅读时症状加重评分(OSDI)影响开夜车程度评分(OSDI)影响电脑工作程度评分(OSDI)影响看电视程度评分(OSDI)MUC16rsPrsPrsPrsPrsPrsPrsPrsPMUC1380.6220.003-0.4980.001-0.0840.6160.0790.664-0.0120.9630.0930.631-0.0870.6240.6350.0001MUC438-0.0260.914-0.1190.478-0.3930.015-0.2440.172-0.2760.268-0.280.141-0.1530.3880.1280.445MUC16340.2350.319-0.2190.187-0.2730.098-0.3700.034-0.5580.016-0.4980.006-0.5150.002—— 注:(Spearman秩相关分析) MUC:黏蛋白;VDT:视频播放终端;OSDI:眼表疾病指数量表 Note:(Spearman correlation analysis) MUC:mucin;VDT:video display terminal;OSDI:Ocular Surface Disease Index;DEQS:Dry Eye-Related Quality-of-Life Score Questionnaire

2.5 不同程度症状体征组干眼患者结膜MUC1、MUC4、MUC5AC及MUC16 mRNA相对表达量比较

症状体征较轻的患者MUC1、MUC4及MUC16 mRNA相对表达量均较正常对照组升高,差异有统计学意义(Z=245,P<0.001;Z=342,P=0.009;Z=366,P=0.022),MUC5AC mRNA相对表达量较正常对照组降低,差异有统计学意义(Z=106,P=0.015);症状重体征轻的患者MUC1 mRNA相对表达量较正常对照组升高,差异有统计学意义(Z=112,P=0.039)。症状轻体征重和症状重体征重者MUC16 mRNA相对表达量均较正常对照组升高,差异有统计学意义(Z=236,P=0.010;Z=80,P=0.004),MUC1、MUC4及MUC5AC mRNA相对表达量与正常对照组比较差异均无统计学意义(均P>0.05)(表5～8)。

表5 不同程度症状体征组结膜中MUC1 mRNA相对表达量比较[M(Q1,Q3)]Table 5 Comparison of relative expression of MUC1 mRNAin conjunctiva among groups with different degreesof symptoms and signs [M(Q1,Q3)]组别眼数MUC1 mRNA相对表达量正常对照组391.52(0.55,2.01)干眼组症状轻体征轻284.47(2.01,6.57)a干眼组症状重体征轻105.02(0.67,8.70)a干眼组症状轻体征重211.81(0.001,3.81)干眼组症状重体征重102.11(0.01,4.75)H值18.49P值0.001 注:与正常对照组比较,aP<0.05(Kruskal-Wallis H 检验,Nemenyi检验) MUC1:黏蛋白1 Note:Compared with normal control group,aP<0.05 (Kruskal-Wallis H test,Nemenyi test) MUC1:mucin 1

表6 不同程度症状体征组结膜中MUC4 mRNA相对表达量比较[M(Q1,Q3)]Table 6 Comparison of relative expression of MUC4 mRNAin conjunctiva among groups with different degreesof symptoms and signs [M(Q1,Q3)]组别眼数MUC4 mRNA相对表达量正常对照组392.72(1.36,3.08)干眼组症状轻体征轻286.29(3.05,9.27)a干眼组症状重体征轻102.51(1.09,4.08)干眼组症状轻体征重212.49(0.92,4.38)干眼组症状重体征重92.85(0.53,3.09)H值8.07P值0.089 注:与正常对照组比较,aP<0.05(Kruskal-Wallis H 检验,Nemenyi检验) MUC4:黏蛋白4 Note:Compared with normal control group,aP<0.05 (Kruskal-Wallis H test,Nemenyi test) MUC4:mucin 4

表7 不同程度症状体征组结膜中MUC5AC mRNA相对表达量比较[M(Q1,Q3)]Table 7 Comparison of relative expression of MUC5ACmRNA in conjunctiva among groups with different degreesof symptoms and signs [M(Q1,Q3)]组别眼数MUC5AC mRNA相对表达量正常对照组262.76(0.07,2.33)干眼组症状轻体征轻150.25(0.01,0.51)a干眼组症状重体征轻35.35(0.001,9.67)干眼组症状轻体征重153.40(0.02,5.93)干眼组症状重体征重70.87(0.06,0.95)H值6.26P值0.181 注:与正常对照组比较,aP<0.05(Kruskal-Wallis H 检验,Nemenyi检验) MUC5AC:黏蛋白5AC Note:Compared with normal control group,aP<0.05 (Kruskal-Wallis H test,Nemenyi test) MUC5AC:mucin 5AC

表8 不同程度症状体征组结膜中MUC16 mRNA相对表达量比较[M(Q1,Q3)]Table 8 Comparison of relative expression of MUC16mRNA in conjunctiva among groups with different degreesof symptoms and signs [M(Q1,Q3)]组别眼数MUC16 mRNA相对表达量正常对照组381.29(0.54,1.97)干眼组症状轻体征轻272.19(0.91,3.75)a干眼组症状重体征轻101.86(0.97,2.76)干眼组症状轻体征重212.61(0.98,3.91)a干眼组症状重体征重103.21(1.57,5.15)aH值11.65P值0.02 注:与正常对照组比较,aP<0.05(Kruskal-Wallis H 检验,Nemenyi检验) MUC16:黏蛋白16 Note:Compared with normal control group,aP<0.05 (Kruskal-Wallis H test,Nemenyi test) MUC16:mucin 16

3 讨论

研究表明,干眼的病理改变伴随着眼表黏蛋白的改变[14]。本研究结果显示,与正常人相比,干眼患者眼表跨膜黏蛋白MUC1和MUC16 mRNA表达水平升高,并且MUC1 mRNA表达水平与TBUT、角膜染色评分显著相关。研究表明,跨膜黏蛋白具有润滑、抗炎、抗菌以及亲水作用[18]。有研究报道炎症介质释放可促进MUC1表达升高,MUC1表达上调可通过抑制Toll样受体通路而抑制炎症,并且MUC1和MUC16通过抑制白细胞介素6、白细胞介素8及肿瘤坏死因子α来调节眼表炎症[19-21]。本研究入组患者主要以轻中度干眼患者为主,我们推测干眼早期阶段,其结膜上皮细胞功能尚完好,眼表微环境还未完全失衡,机体受到干眼刺激及引起的轻微炎症而处于应激状态,结膜上皮细胞可能应激过表达黏蛋白用于抵抗眼表刺激和早期炎症[11,18]。

跨膜黏蛋白在干眼中的变化情况一直未明确,其结果差异较大。其中一个主要原因是这些研究中患者入组标准不完全相同,一些研究纳入了有全身因素(如干燥综合征)的患者[12],而一些研究同时纳入首诊和复诊干眼患者[11]。由于入组条件不一致,其可比性较差。应用治疗干眼药物可影响患者黏蛋白表达[22]。因而只有纳入未影响眼表的全身性疾病、未进行过眼表药物治疗的患者才能反映患者黏蛋白表达的真实情况。本研究是目前首次研究无全身疾病首诊干眼患者的结膜黏蛋白表达情况,能更清晰地反映干眼原始的病理改变情况。

MUC1是最小的黏蛋白,但其具有许多功能,MUC1有利于黏蛋白层的分布,并且被认为是黏膜细胞表面形成黏膜屏障的关键黏蛋白,失去MUC1的黏膜上皮易受病原微生物感染[23]及增加染料渗透。另有报道称,MUC1缺失的小鼠结膜炎和睑缘炎的发生率更高[24]。因此,MUC1对维持眼表正常微环境具有重要作用。本研究中通过Spearman秩相关分析发现,MUC1的表达与TBUT呈正相关,与角膜及结膜染色评分呈负相关,说明MUC1表达影响干眼体征的严重程度。

MUC16是位于角膜和结膜上皮细胞顶端膜上的跨膜黏蛋白,在抗菌、维持角膜屏障功能和信号转导等方面起着重要作用[25]。一些研究发现在干眼患者中MUC16表达增加[11,13]。MUC16上调被认为是眼表上皮细胞处于应激状态时释放的保护性信号[26]。本研究发现干眼患者结膜组织中MUC16表达增加。Spearman秩相关分析发现,MUC16表达与干眼患者生活质量相关,反应了MUC16具有保护性作用。

本研究还存在一些不足:首先,所检测的MUC5AC相对表达量较低,甚至部分样本测不出MUC5AC序列,考虑与样本收集后未及时冷冻而造成部分RNA降解有关。其次,首诊干眼患者多数以轻中度干眼为主,极少数为重度干眼患者,因此重度干眼患者数量较少,可能存在偏倚,仍需增大样本量进一步研究。此外,由于条件不足,印迹细胞采集无法满足实验室蛋白检测所需的样本浓度,因此未检测干眼患者黏蛋白的蛋白水平,同时在基因层面仅选择最常研究的4种黏蛋白作为研究对象。而随着泪液蛋白质检测手段的不断更新,泪液蛋白质组学的检测方式将为我们提供更加全面的蛋白层面的分析[27],这将是今后进一步的研究工作。

综上所述,首诊干眼患者结膜黏蛋白MUC1和MUC16表达增加,其中MUC1表达与患者干眼体征相关,MUC16表达与患者的生活质量相关。

利益冲突资金提供者与ADES/主要研究者/协助研究者在计划、实施和报告研究方面的关系不影响研究结果及其解读。参与者的权益可得到保障

作者贡献声明刘祖国、邓应平、孙旭光:参与选题、研究设计和研究标准化制定、数据分析结果的审核、论文智力性内容的修改及定稿;欧阳维杰:参与研究实施、数据采集及分析、论文撰写及修改;李青松、黄彩虹、林祥、朱莉:参与研究实施、参数测量、数据采集及分析、论文修改

志谢感谢日本参天株式会社对本研究提供资金资助