基于iTRAQ技术对化疗所致认知障碍机制的研究

周雅卿 马 莉 王 力 李维妙 刘伟东 赵永林

一些肿瘤患者在化疗期间和化疗后出现认知能力下降,这种认知障碍通常被称为化疗相关认知障碍(chemotherapy-induced cognitive impairment,CICI),也称化疗脑(chemo-brain),主要表现为患者的记忆力衰退,学习能力下降,注意力、推理能力及执行能力等方面较前减退。在癌症幸存者中CICI的患病率为14%～85%,最常见的症状是记忆力以及注意力较前减退。CICI具有差异性,多数情况下是短暂且可逆的,但也可以持续数年,或有更严重的进行性恶化,从而影响患者的生活质量[1]。

目前对于CICI的发病机制尚无定论,CICI的发生可能与化疗导致的海马细胞损伤、DNA损伤、修复障碍、炎性反应、激素水平变化等有关,且目前国内外尚无有关CICI发生后脑组织蛋白质水平的变化和系统研究。iTRAQ技术联合液相色谱串联质谱常用于蛋白质组定量,可以筛选出差异蛋白。本研究拟应用iTRAQ技术检测经阿霉素和环磷酰胺处理后大鼠海马组织的差异表达蛋白,有助于揭示CICI的发生机制,并寻找其潜在的生物学标志物。

材料与方法

1.实验动物及大鼠CICI模型制备:由西安交通大学医学院实验动物中心提供6只具有相同遗传背景的健康成年雄性SD大鼠,体质量为250～300g,动物试验许可证号:SCXK(陕)08-018,西安交通大学医学部生物医学伦理学委员会已批准此次实验伦理。随机将6只健康成年雄性SD大鼠分为化疗组及对照组各3只。化疗组大鼠尾静脉注射环磷酰胺(40mg/kg)和阿霉素(4mg/kg),每周1次,连续3周;对照组注射等剂量的0.9% NaCl注射液。

2．取材及样品制备:末次给药结束后1周,腹腔麻醉两组大鼠后快速开胸,经左心室插管至主动脉后开始灌注0.9% NaCl注射液,待流出液清亮后迅速取大鼠海马组织,置于无菌冻存管后,于干冰中冻存运输。

3．蛋白提取、定量质检及质谱分析:将组织解冻后加适量含EDTA的Cocktail,置于冰上5min,加入终浓度为10mmol/L的DTT后裂解,离心后取上清,加入10mmol/L的DTT,56℃中水浴1h。加入IAM(55mmol/L)后避光静置45min,离心后取上清。考马斯亮蓝染色法测定蛋白浓度,采用SDS-PAGE电泳法评估样品质量。取100μg蛋白液加入到1.5ml离心管中,37℃酶解4h。对肽段消化后除盐并冷冻抽干,用TEAB溶解肽段样品后对其进行标记及分离后冷冻抽干,用流动相A复溶肽段后离心取上清。使用美国Thermo公司UltiMate 3000 UHPLC进行分离。将液相分离后的肽段通过nanoESI源离子化后进入串联质谱仪进行DDA模式检测。

4.生物信息学统计:将原始质谱数据转成MGF格式后经Mascot软件和蛋白质序列数据库比对搜索得到的蛋白鉴定结果。同时进行质控分析,并对所得蛋白质鉴定结果进行筛选。随后经iTRAQ定量分析筛选显著差异蛋白,通过超几何检验对差异蛋白进行富集分析。利用STRING蛋白互作数据库对差异表达蛋白进行互作分析,绘制网络互作图。

结 果

1.差异蛋白鉴定及定量分析:利用Mascot2.3.02软件在Rattus_norvegicus数据库中进行蛋白鉴定和分析,共鉴定出52764 条肽段和7670个蛋白,进行iTRAQ定量分析,以iTRAQ比值>1.2和P<0.05两个条件筛选,共鉴定出434种差异蛋白,与对照组比较,化疗组上调338种蛋白,下调96种蛋白(图1)。

图1 实验组与对照组差异蛋白火山图

2.差异蛋白生物信息学分析:通过显著差异蛋白和作为背景的全体鉴定蛋白比较,利用超几何检验(P<0.05)找出显著富集的GO条目,依据相关生物学过程、细胞组成、分子功能对化疗组与对照组的差异表达蛋白进行GO分类富集,结果显示差异蛋白主要富集于细胞组分、细胞器、细胞膜等细胞成分;参与细胞过程、生物调节、代谢过程等生物学过程;显著富集于结合、催化、调节等分子功能(P<0.05),详见图2。

图2 差异蛋白GO富集分析

3.差异表达蛋白KEGG通路富集分析结果:对差异表达蛋白进行KEGG信号通路富集分析,结果显示其主要富集的通路有单纯疱疹病毒感染、免疫排斥、自身免疫性甲状腺疾病等,详见图3。

图3 差异蛋白KEGG通路富集气泡图

4.差异蛋白互作网络分析:对化疗组和对照组的差异蛋白进行蛋白互作网络分析,发现差异蛋白主要与免疫相关,与KEGG通路富集分析一致,其中信号>转导及转录激活因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)及泛素样修饰剂ISG15连接度较高。

讨 论

在过去几十年中,由于认为化疗药物不会通过血-脑脊液屏障损伤大脑以及对化疗后患者后续随访的缺失,导致研究者忽视了CICI这一化疗常见不良反应。随着长期癌症幸存者人数的逐年增加及对化疗不良反应的深入探究,CICI受到了越来越多的关注。目前对CICI的认定依靠于标准化的神经心理学测试、电生理及神经影像技术等,对于CICI的诊断仍缺乏客观、有效的指标。另外,有关CICI 的机制还尚不明确,基于目前的研究其可能机制包括直接的神经毒性作用、血-脑脊液屏障的破坏、海马功能障碍、神经元增殖破坏、继发性炎性反应、白质异常、氧化应激增加和脑血流改变等[3]。

本研究拟通过iTRAQ技术发现潜在的靶点蛋白,为CICI机制的研究及筛选可能的生物学标志物提供相关科研依据。本实验共筛选出434种差异蛋白,其中上调的差异蛋白有338种,下调的有96种,对差异蛋白进行GO 功能富集分析,结果显示差异蛋白主要富集于细胞器、细胞膜等细胞成分;主要参与细胞代谢过程、生物调节及代谢过程等生物学过程;显著富集于结合、催化等分子功能。对差异蛋白进行KEGG信号通路富集分析显示其主要富集于单纯疱疹病毒感染、免疫排斥、自身免疫性甲状腺疾病等与免疫相关的通路。通过构建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络发现信号转导及STAT及泛素样修饰剂ISG15处于中心位置,均与免疫相关,与KEGG通路富集分析结果一致。

联合使用阿霉素和环磷酰胺被广泛用于肿瘤患者的辅助化疗,尽管阿霉素及其主要代谢物均未穿过血-脑脊液屏障,但仍会导致脑损伤,可能的机制包括氧化应激增加、促炎性细胞因子水平升高、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)水平升高和线粒体功能障碍[4～7]。轻松穿过血-脑脊液屏障或通过脑室器官进入大脑的促炎性细胞因子可以激活小胶质细胞,加剧损伤部位促炎性细胞因子的产生。小胶质细胞激活后活化巨噬细胞释放促炎性细胞因子,在神经炎症中有至关重要的作用[8]。此外,即使不进入大脑,促炎性细胞因子也可以通过破坏血-脑脊液屏障的微血管内皮细胞间的紧密连接,增加其通透性[9]。在结果中IFN-γ显著上调,IFN-γ广泛参与先天性和适应性免疫反应的调节。Shechter等[10]研究发现在脊髓损伤后,单核细胞归巢于受损组织分为两个阶段。第一阶段,受损组织周围软脑膜可协助循环单核细胞集中于受损组织成为具有促炎作用的M1型巨噬细胞,IFN-γ参与M1型巨噬细胞的活化。第二阶段,脉络从可通过调节 IFN-γ/IFN-γR 信号转导协调单核细胞进入中枢神经系统成为具有抗炎作用的M2型巨噬细胞,决定了中枢神经系统损伤后的免疫监视及损伤恢复[10,11]。神经炎症是CICI可能机制之一,通过调控IFN-γ或控制单核细胞进入中枢神经系统从而减轻神经炎症有望改善CICI。

JAK/STAT通路在先天性免疫和获得性免疫的启动和调节中起着关键作用,JAK/STAT途径的异常激活在多发性硬化症和帕金森病等神经炎性疾病的发病机制中有重要作用[12]。细胞因子和神经营养因子与细胞膜上的特异性受体结合,使受体亚基多聚化诱发细胞内激活,激活的JAKs磷酸化酪氨酸残基与STAT对接,致使STAT磷酸化形成二聚体,二聚化的STAT从细胞质易位到细胞核中,通过与特异性DNA元件结合调节细胞因子反应基因的表达[13]。本研究结果显示,在JAK/STAT通路中,上调的细胞因子及神经营养因子激活JAK/STAT通路,二聚化的STAT进入细胞核后使AOX表达上调,AOX通过调控脂质代谢影响细胞周期。但JAK/STAT通路作用机制十分复杂,需进一步研究确定其对CICI的影响。

下调的差异蛋白丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶使丝氨酸/精氨酸富集剪接因子1磷酸化抑制前体mRNA选择性剪接,提示可能与CICI有关,但需要进一步的研究证实。

目前对于CICI的机制还缺乏明确及清晰的认识,本研究利用iTRAQ技术筛选与CICI有关的通路及蛋白。结果进一步说明CICI与神经炎症有关,尤其是CICI与自身免疫的相关性值得进一步研究。细胞因子,特别是IFN-γ可能是CICI潜在的生物学标志物及治疗靶点。本研究为后续CICI机制的探究提供了一定的方向及依据,希望在此基础上有更深层次的研究揭示CICI的发病机制,为缓解及治疗CICI带来新希望。