青蒿琥酯对糖尿病大鼠MEK/ERK通路及心肌纤维化的影响

杨 萍,代 天,刘 波,邹 勇,赵 谦,张苏川

糖尿病是一种高发的疾病,病人血糖浓度长期处于高水平,引发胶原纤维过度积累,造成多种组织器官纤维化变性,其中心肌纤维化是糖尿病病人常见的并发症,可严重损伤心脏的收缩、舒张功能,导致心力衰竭、恶性心律失常和心源性猝死等心脏疾病,是晚期糖尿病病人死亡的主要原因[1-2]。高糖环境可引发机体严重的炎症反应,促使心肌细胞凋亡,进而导致心肌组织胶原沉积,引发心肌纤维化[3-4]。丝裂原细胞外信号调节激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)通路在心肌梗死病理过程中发挥着重要调控作用,降低MEK、ERK磷酸化水平,可起到抗炎、抗氧化作用,减轻心肌组织炎症损伤,抑制成纤维细胞分化,缓解心肌纤维化,修复心功能,由此可知MEK/ERK信号通路是改善心肌纤维化的主要治疗靶点[5-6]。青蒿琥酯是青蒿素的一种半合成衍生物,具有抗疟疾、抗炎、调节免疫等广泛的生物学作用,可降低促炎因子表达,减轻糖尿病大鼠肾组织炎症损伤,还可抑制其视网膜病变[7-8]。本研究观察青蒿琥酯对糖尿病大鼠MEK/ERK通路及心肌纤维化的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级SD大鼠[生产许可证号:SCXK(沪)2017-0004,购自上海茂生衍生物科技有限公司],雌雄各半,体质量200～240 g,饲养在温度25 ℃、相对湿度55%的本院动物房中,将室内环境维持在清洁级,并保持安静、通风良好,自然照明,大鼠自由进食、饮水。

1.2 主要试剂及仪器 青蒿琥酯购自上海宝曼生物科技有限公司[高效液相色谱(HPLC)≥98%,货号D1085];盐酸二甲双胍片购自中美上海施贵宝制药有限公司(规格:每片0.5 g,国药准字H20023370);链脲佐菌素购自西安热默尔生物科技有限公司(纯度99%,货号0210055701);Masson染色试剂盒购自上海信裕生物科技有限公司(货号XY-4422-1);大鼠肌酸激酶同工酶(CK-MB)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海雅吉生物科技有限公司(货号YS06433B);大鼠肌钙蛋白I(cTnI)ELISA试剂盒购自厦门仑昌硕生物科技有限公司(货号LCS34521);大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-6(IL-6)ELISA试剂盒、兔源磷酸化MEK(p-MEK)一抗、兔源MEK一抗、兔源ERK一抗、兔源甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)一抗及兔源p-ERK一抗、羊抗兔二抗购自美国Abcam公司(货号分别为ab5603、ab100772、ab96379、ab178876、ab32537、ab1194、ab192591、ab150077);BCA试剂盒购自上海碧云天公司(货号P0011);RIPA裂解液购自南京森贝伽生物科技有限公司(货号BI-WB012)等。XElx800酶标仪购自Perkin Elmer公司(美国);BX-4000全自动生化分析仪购自南京新惠通生物科技有限公司(中国);RM2235病理切片机购自上海徕卡仪器有限公司(中国);ECLIPSE CI正置光学显微镜购自NIKON公司(日本);Trans-Blot Turbo快速转膜仪、1659001蛋白电泳仪均购自Bio-Rad公司(美国);GIS-500凝胶成像仪购自杭州米欧仪器有限公司(中国)等。

1.3 方法

1.3.1 动物模型制备及分组给药 糖尿病模型大鼠参考文献[9]中方法制备,以60 mg/kg的链脲佐菌素溶液腹腔注射,72 h后测量血糖含量至少2次,均高于16.7 mmol/L表明模型建立成功,建模65只,共成功60只,随机分为模型组、青蒿琥酯低剂量组、青蒿琥酯中剂量组、青蒿琥酯高剂量组、二甲双胍组,每组12只。另取12只SD大鼠设为对照组,腹腔注射等剂量生理盐水。

将青蒿琥酯溶于生理盐水,获得2.5 mg/mL、5.0 mg/mL、10.0 mg/mL的溶液[10],将二甲双胍片粉碎溶于生理盐水中,制备成7 mg/mL的溶液[11]。药物处理组给药剂量均为10 mL/kg,给药方式为灌胃,对照组与模型组大鼠灌胃等剂量生理盐水,每日1次,持续14 d。

1.3.2 血糖、总胆固醇(TC)和三酰甘油(TG)检测及标本收集 给药结束24 h后,以5 mL注射器经尾静脉取血4 mL,取其中2 mL,4 ℃环境下以3 000 r/min速率离心15 min,收集上清液于-80 ℃冰箱中储存备用,剩余血液用于全自动生化分析仪检测血糖、TC和TG水平。以乙醚麻醉大鼠后断头处死,解剖得到心脏,剪取约0.5 g心肌组织,剪碎,加入RIPA裂解液,冰水浴中匀浆制备为匀浆液,4 ℃环境下以3 000 r/min速率离心20 min,收集血清,采用二喹啉甲酸(BCA)法测定总蛋白浓度后调整至相同,具体操作参照试剂盒说明书步骤进行,储存在液氮中备用;剩余心肌组织采用4%多聚甲醛溶液固定处理,然后依次经80%、90%、100%的乙醇溶液脱水,再以二甲苯透明、石蜡包埋、切片机切片,得到连续病理切片备用,厚度为2 μm。

1.3.3 大鼠心肌组织纤维化情况检测 将切片做脱蜡处理后,依次经100%、90%、80%的乙醇溶液浸泡,采用Masson试剂盒进行染色,具体步骤参照说明书进行,再次经脱水、透明后封片,在光学显微镜下观察心肌组织纤维化情况,任选5个视野采集图像。

1.3.4 血清CK-MB、cTnI、IL-6及TNF-α水平检测 将血清标本置于4 ℃冰箱中解冻,采用ELISA法检测CK-MB、cTnI、IL-6及TNF-α水平,具体步骤参照试剂盒说明书进行。

1.3.5 大鼠心肌组织MEK/ERK通路蛋白表达检测 将心肌组织蛋白样品液置于冰水浴中缓慢解冻,每组各取20 μL上样,恒压110 V下电泳分离蛋白,恒压110 V下湿转,转移蛋白到聚偏二氟乙烯膜(PVDF),于5%脱脂奶粉溶液中室温下封闭2 h,然后以兔源GAPDH、MEK、p-MEK、ERK及磷酸化ERK(p-ERK)一抗溶液在4 ℃冰箱中孵育过夜,抗体稀释比例均为1∶2 000,TBST溶液漂洗3次,再置于稀释比例为1∶1 000的羊抗兔二抗溶液中,室温孵育2 h,TBST溶液漂洗3次,经增强化学发光法显色后以凝胶成像仪拍照,采用Quantity One软件对所得图片进行分析,测定各蛋白的相对表达量。

2 结 果

2.1 各组血糖、TC、TG水平比较 与对照组比较,模型组血糖、TC、TG水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,青蒿琥酯低剂量组、青蒿琥酯中剂量组、青蒿琥酯高剂量组、二甲双胍组血糖、TC、TG水平降低,且青蒿琥酯各剂量组呈剂量依赖性,差异均有统计学意义(P<0.05),青蒿琥酯高剂量组与二甲双胍组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组血糖、TC、TG水平比较 单位:mmol/L

2.2 各组大鼠心肌纤维化情况比较 与对照组比较,模型组大鼠心肌组织胶原纤维增多,呈现明显纤维化变性。与模型组比较,青蒿琥酯低剂量组、青蒿琥酯中剂量组、青蒿琥酯高剂量组、二甲双胍组心肌组织胶原纤维减少,纤维化变性减轻,且随着青蒿琥酯剂量升高而逐渐减轻,青蒿琥酯高剂量组与二甲双胍组比较,纤维化变性程度无明显差异。详见图1。

图1 Masson染色检测各组大鼠心肌纤维化情况(×400)

2.3 各组血清CK-MB、cTnI水平比较 与对照组比较,模型组大鼠血清CK-MB、cTnI水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,青蒿琥酯低剂量组、青蒿琥酯中剂量组、青蒿琥酯高剂量组、二甲双胍组大鼠血清CK-MB、cTnI水平降低,且青蒿琥酯各组呈剂量依赖性,差异均有统计学意义(P<0.05),青蒿琥酯高剂量组与二甲双胍组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组血清CK-MB、cTnI水平比较

2.4 各组大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较 与对照组比较,模型组血清TNF-α、IL-6水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,青蒿琥酯低剂量组、青蒿琥酯中剂量组、青蒿琥酯高剂量组、二甲双胍组血清IL-6、TNF-α水平降低,且青蒿琥酯各组呈剂量依赖性,差异均有统计学意义(P<0.05),青蒿琥酯高剂量组与二甲双胍组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较 单位:pg/mL

2.5 各组大鼠心肌组织MEK/ERK通路蛋白表达比较 与对照组比较,模型组心肌组织MEK/ERK通路蛋白p-MEK/MEK、p-ERK/ERK明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,青蒿琥酯低剂量组、青蒿琥酯中剂量组、青蒿琥酯高剂量组、二甲双胍组大鼠心肌组织MEK/ERK通路蛋白p-MEK/MEK、p-ERK/ERK降低,且青蒿琥酯各组呈剂量依赖性,差异均有统计学意义(P<0.05),青蒿琥酯高剂量组与二甲双胍组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。详见表4、图2。

图2 蛋白免疫印迹法检测各组大鼠心肌组织MEK/ERK通路蛋白表达

表4 各组大鼠心肌组织MEK/ERK通路蛋白相对表达量比较

3 讨 论

我国糖尿病病人众多,数量居全球首位,且近年来发病率逐渐上升,严重影响人民身心健康,防控形势十分严峻,糖尿病心肌病是糖尿病病人的一种常见并发症,心肌间质纤维化是其主要病理特征[12-13],高血糖可使活性氧、促炎细胞因子大量合成与释放,引发严重炎症反应,导致细胞外基质和胶原纤维沉积,是糖尿病心肌病的主要致病机制[14-15]。心肌细胞凋亡时,CK-MB、cTnI可大量释放入血,使血清中含量升高,可作为心肌损伤的标志物[16]。本研究通过腹腔注射链脲佐菌素溶液构建糖尿病大鼠模型,结果显示建模大鼠心肌组织胶原纤维增多,呈现明显纤维化变性,大鼠血糖、TC、TG、CK-MB、cTnI、TNF-α及IL-6水平明显升高,表明链脲佐菌素可导致大鼠糖脂代谢紊乱,升高血糖、血脂水平,促使炎性因子TNF-α、IL-6大量合成与释放,造成心肌组织炎症损伤,引发心肌纤维化变性,表明模型建立成功。

青蒿琥酯作为青蒿素的一种衍生物,可清除活性氧自由基,降低促炎因子合成释放,抑制炎症反应发生发展,促使糖尿病病人皮肤伤口愈合,还能通过增强自噬作用抑制肾组织纤维化,保护糖尿病大鼠肾功能[17-18],但青蒿琥酯对糖尿病心肌纤维化的影响目前还未见报道。本研究结果显示,糖尿病模型大鼠经不同剂量青蒿琥酯处理后心肌组织纤维化程度减轻,且纤维化程度随剂量升高而逐渐递减,血糖、TC、TG、CK-MB、cTnI、TNF-α及IL-6水平降低,且青蒿琥酯各组呈剂量依赖性,表明青蒿琥酯可改善糖尿病大鼠糖脂代谢紊乱,降低血糖、血脂及促炎因子水平,抑制炎症反应,减轻心肌损伤,减缓心肌纤维化进程,且随青蒿琥酯剂量升高而作用增强。

MEK/ERK是机体介导炎症反应的主要信号通路,研究发现,在心肌损伤及心肌纤维化过程中,该信号处于激活状态,降低其通路相关蛋白MEK、ERK磷酸化水平,可抑制心肌梗死大鼠炎症反应,改善纤维化病变,修复心功能[19-20],因而MEK/ERK信号通路可能作为糖尿病心肌纤维化的潜在治疗靶点。本研究结果显示,糖尿病模型大鼠心肌组织MEK/ERK通路蛋白p-MEK/MEK、p-ERK/ERK明显升高,以不同剂量的青蒿琥酯处理后,其心肌组织蛋白p-MEK/MEK、p-ERK/ERK降低,且青蒿琥酯各组呈剂量依赖性,表明青蒿琥酯可降低MEK/ERK通路蛋白磷酸化水平,抑制心肌炎症反应,减轻心肌纤维化变性。

综上所述,青蒿琥酯可减弱MEK、ERK磷酸化,降低促炎因子水平,阻止炎症发生发展,改善糖尿病大鼠糖脂代谢,减轻心肌炎症损伤,缓解心肌纤维化变性,为糖尿病心肌病的临床治疗提供了新的参考,抑制MEK/ERK通路可能是其药理机制之一,后续研究需以MEK/ERK通路激动剂及抑制剂来进行对照验证,进而对其药理机制进行更全面的阐释。