银杏二萜内酯K 对D-半乳糖诱导的小鼠原代星形胶质细胞抗衰老作用

操娇娇，杜雨芯，张倩霞，吴 伟，杨颖博，肖保国，肖 伟，王振中*

1. 南京中医药大学，江苏 南京 210000

2. 上海中医药大学中药研究所，上海 200120

3. 中药制药过程与智能制造技术全国重点实验室，江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001

4. 上海复旦大学神经病学研究所，上海 200040

脑细胞主要由神经元和神经胶质细胞（小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞等）组成。星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的细胞类型，在维持中枢神经系统复杂功能和脑环境的稳态中发挥着极其重要作用[1]，包括调节突触传递、维持血脑屏障、为神经元提供结构支撑、营养支持等作用[2]。细胞衰老是人体衰老的基本机制之一，是与年龄相关的神经退行性疾病的核心组成部分。衰老细胞特征包括细胞周期停滞、细胞衰老相关分泌表型、DNA 损伤、衰老相关β-半乳糖苷酶的表达、细胞周期抑制蛋白的表达等。这些表征的衰老细胞可损害脑组织的结构和功能，引发突触损失和认知能力下降，增加衰老相关疾病的发病率，或推动年龄相关的疾病进一步恶化[3]。因此，靶向星形胶质细胞的衰老治疗可能是缓解年龄相关神经退行性疾病发生和进展的一种有潜力的治疗方式。

银杏二萜内酯K（ginkgolide K，GK）是从银杏叶中分离出来的二萜内酯类成分，GK 作为银杏二萜内酯B（ginkgolide B，GB）的同系物，也是血小板活化因子受体（platelet-activating factor，PAF）的拮抗剂，其抗氧化应激和对急性缺血性卒中的抗血小板聚集和神经保护作用备受关注[4-7]。本研究通过D-半乳糖诱导原代星形胶质细胞衰老模拟脑内星形胶质细胞衰老，探索GK 抗衰老的作用，同时初步探索其可能的抗衰老作用机制。

1 材料

1.1 动物

SPF 级ICR 新生鼠购自上海必凯科翼生物科技有限公司，实验动物许可证号为SCXK（沪）2018-0006。动物实验通过上海中医药大学动物实验伦理审查（批准号PZSHUTCM220110002）。

1.2 药品与试剂

GK（质量分数≥98%）由江苏康缘药业股份有限公司中药制药过程与智能制造技术全国重点实验室制备；D-半乳糖（质量分数≥99%，批号JF68252A）购自上海泰坦科技股份有限公司；DMEM 培养基（批号MA0212）购自大连美仑生物技术有限公司；胎牛血清（批号10099-141C）购自美国Gibco 公司；PBS（批号ST447）、胰酶细胞消化液（批号C0203）、β-半乳糖苷酶染色试剂盒（批号C0602）、RIPA 裂解液（批号P00138）、PMSF（批号ST505）、蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物（批号P1045）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号P0012）、SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（批号P0015L）、ECL化学发光液（批号P0018FS）购自中国碧云天生物技术有限公司；NC 膜（批号66485）、PVDF 膜（批号6054520）购自美国Pall 公司；p53 抗体（批号2524S）、核纤层蛋白B1（Lamin B1）抗体（批号13435S）、沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）抗体（批号9475S）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）抗体（批号47808S）、Ki67 抗体（批号9449S）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗体（3670S）、β-actin 抗体（批号4970S）、HRP 标记的山羊抗兔IgG 抗体（批号7074S）、HRP 标记的山羊抗小鼠IgG 抗体（批号7076P2）购自美国CST 公司；p21 抗体（批号ab109199）、p62 抗体（批号ab109012）购自英国Abcam 公司；微管相关蛋白1 轻链3-Ⅱ/I（microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅱ/I，LC3-Ⅱ/I）抗体（批号NB100-2220）购自美国Novus 公司；Cy3 标记的山羊抗小鼠IgG 抗体（批号A0521）购自中国碧云天生物技术有限公司；小鼠白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA 试剂盒（批号DY406-05）、小鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 试剂盒（批号DY410-05）、小鼠IL-1β ELISA 试剂盒（批号DY401-05）购自美国R&D Systems 公司。

1.3 仪器

Synergy H1 型多模式微孔检测系统（美国Bio-Tek 公司）；Universal Hood Ⅱ Chemi Doc XRS 系统、PowerPac HC 蛋白印迹转印系统（美国Bio-Rad 公司）；DM6B 型荧光显微镜（德国Leica 公司）。

2 方法

2.1 原代星形胶质细胞的提取与培养

在超净台无菌环境下，取出生24 h 内新生小鼠，置洁净大皿，75%乙醇消毒后，用经高温高压灭菌后的手术剪，快速剪下整个头，再剪开头盖骨，用镊子小心取下2 片皮层，置于无血清的DMEM 培养基中，待10 只新生鼠全部取完，用洁净的巴氏管吹打皮层，直至在灯光下观察无明显团块或聚集，培养基呈混悬状，300×g离心5 min，弃无血清DMEM 培养基。加入含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM 完全培养基适量，继续用巴氏管吹打混匀，经70 μm 细胞滤膜滤过，除去未吹散的团块，加入含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM 培养基至60 mL，混匀，每只大皿加6 mL 含细胞的完全培养基。放入37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育，细胞在培养箱中孵育24～36 h 后，轻轻摇晃后将所有培养上清回收，2500 r/min 快速离心，除去沉淀，上清重新加入大皿，不足6 mL 则用新鲜完全培养液补充。每隔1 d 置换一半新鲜培养液，至第7 天，细胞铺满皿底，摇床置培养箱中360 r/min 摇晃3～4 h 除去小胶质细胞和其他杂细胞。加入3 mL PBS 清洗2次，胰酶消化1 min，吹下细胞后800 r/min 离心3 min，吸去上清，加入2 mL 新鲜完全培养液，细胞计数后根据所需，即可种板进行后续实验。GFAP 免疫荧光染色显示星形胶质细胞纯度＞95%。

2.2 β-半乳糖苷酶衰老染色

将原代星形胶质细胞以1.6×105个/孔接种于6孔板，待细胞生长至铺满皿底80%时即可实验。加入GK（50 μg/mL）[8]预处理3 h，然后添加150 mmol/LD-半乳糖造模6 d，另设置不含药物的对照组。实验结束后，除去培养基，用1 mL PBS 清洗1次，吸净PBS。每孔加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液室温固定15 min，PBS 清洗3 次后，每孔加入1 mL 染色工作液，用保鲜膜封住，37 ℃孵育过夜。次日除去染色工作液，加入1 mL PBS，于显微镜下观察并拍照，使用Image J 软件对蓝色染色区域进行定量分析。

2.3 Western blotting 检测p53、p21、Lamin B1、BDNF、SIRT1、p62 和LC3Ⅱ/I 蛋白表达

将原代星形胶质细胞以1.6×106个/皿接种于大皿，待细胞生长至铺满皿底80%时即可实验。GK（50 μg/mL）预处理3 h，然后添加150 mmol/LD-半乳糖造模6 d，另设置不含药物的对照组。收集细胞，加入含蛋白酶、磷酸酶抑制剂和PMSF 的RIPA缓冲液裂解，然后用BCA 法测定蛋白浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF 膜，加入5%脱脂奶粉，室温封闭2 h，TBST洗涤，加入相应一抗，4 ℃摇床孵育过夜；TBST 洗涤3 次，每次10 min，加入二抗（1∶1000），室温孵育2 h，TBST 洗涤3 次，加入ECL 发光试剂显影，应用ECL 化学发光成像系统拍照，采用Image J图像分析软件分析条带灰度值。

2.4 免疫荧光检测Ki67 蛋白表达

24 孔板每孔放置1 片爬片，将原代星形胶质细胞以4×104个/孔接种，待细胞生长至铺满皿底80%时即可实验。GK（50 μg/mL）预处理3 h，然后添加150 mmol/LD-半乳糖造模6 d，另设置不含药物的对照组。除去培养液，500 μL PBS 清洗1 遍，吸净PBS，加入300 μL 4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤3 遍，每次5 min；TritonX-100 通透30 min，PBS 洗涤2 遍；加入1%牛血清白蛋白封闭1 h，加入一抗，4 ℃孵育过夜；PBS 洗涤3 遍，每次5 min，加入二抗，室温避光孵育2 h；PBS 洗涤3 遍，每次5 min，加入100 μL DAPI 染核5～10 min；PBS 洗涤1 遍，载玻片滴10 μL 封片液（PBS-甘油1∶1），取出爬片，倒扣于载玻片上，于荧光显微镜下观察并拍照，使用Image J 软件进行分析。

2.5 ELISA 检测IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平

将原代星形胶质细胞以1.6×105个/孔接种于6孔板，待细胞生长至铺满皿底80%时即可实验。GK（50 μg/mL）预处理3 h，然后添加150 mmol/LD-半乳糖造模6 d，另设置不含药物的对照组。收集上清液，按照试剂盒说明书检测IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平。

2.6 统计学分析

3 结果

3.1 GK 抑制D-半乳糖诱导的原代星形胶质细胞衰老

如图1 所示，与对照组比较，D-半乳糖诱导原代星形胶质细胞中β-半乳糖苷酶表达（P＜0.001），上调p53 和p21 表达（P＜0.05、0.01），抑制Lamin B1 和Ki67 表达（P＜0.01），成功构建了星形胶质细胞的衰老模型。50 μg/mL GK 干预6 d 可显著抑制β-半乳糖苷酶阳性表达（P＜0.001），下调p53 和p21 蛋白表达（P＜0.05），上调Lamin B1 和Ki67 的表达（P＜0.01）。表明GK 具有抑制D-半乳糖诱导的原代星形胶质细胞衰老的作用。

图1 GK 抑制D-半乳糖诱导的原代星形胶质细胞衰老Fig. 1 GK inhibits D-galactose induced senescence in primary astrocytes

3.2 GK 抑制D-半乳糖诱导的原代星形胶质细胞衰老相关分泌表型

衰老相关分泌表型是衰老细胞分泌的一系列促炎因子、趋化因子或生长因子等现象，可对细胞的微环境和邻近细胞产生影响。如图2 所示，在原代星形胶质细胞分泌的一系列细胞因子中，D-半乳糖诱导的衰老模型中IL-6 和IL-1β 水平无明显增加，GK 也无明显抑制作用；但衰老的原代星形胶质细胞中TNF-α 的分泌显著升高（P＜0.01），而GK 干预后显著抑制TNF-α 的分泌（P＜0.05），提示GK可抑制衰老相关分泌表型中TNF-α 的分泌。

图2 GK 抑制D-半乳糖诱导的衰老相关分泌表型 (±s, n = 3)Fig. 2 GK inhibits D-galactose induced secretory-associated senescence phenotype (±s, n = 3)

3.3 GK 促进原代星形胶质细胞营养因子释放

分泌神经营养因子是星形胶质细胞的功能之一，可以对神经元的生长发育和功能维持起到营养作用。如图3 所示，与对照组比较，模型组BDNF蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），表明衰老的星形胶质细胞分泌营养因子的功能下降；与模型组比较，GK 显著上调BDNF 蛋白表达（P＜0.05）。

3.4 GK 促进SIRT1 表达和自噬功能

SIRT1 被称为“长寿”蛋白，也被称为细胞年轻化标志分子，与多种生物的衰老过程密切相关，据报道SIRT1 可通过去乙酰化抑制p53 的表达[9]，从而抑制p21 的表达[10]。自噬与衰老之间存在联系，细胞在响应衰老信号的诱导时，自噬被抑制，受损的蛋白和细胞器无法及时降解，将进一步促进衰老通路的激活，导致细胞衰老标志物的累积和生长停滞[11]。如图4 所示，衰老的星形胶质细胞SIRT1 蛋白表达降低（P＜0.05），而GK 可以上调SIRT1 蛋白表达（P＜0.05）。同时D-半乳糖诱导的衰老星形胶质细胞LC3-Ⅱ/I 蛋白表达降低（P＜0.05），自噬底物标志p62 蛋白表达升高（P＜0.001），表明细胞此时的自噬活动减少，导致p62 标记的降解物积聚。GK 干预则增加LC3-Ⅱ/I 蛋白表达（P＜0.01），降低泛素化蛋白p62 蛋白表达（P＜0.01），增加细胞此时的自噬活动，减少p62 标记的降解物积聚。以上结果提示GK 可能通过上调SIRT1 表达，同时促进BDNF 产生和细胞自噬，多维度协同达到抗细胞衰老的效应。

图4 GK 促进星形胶质细胞SIRT1 表达和自噬功能 (±s, n = 3)Fig. 4 GK promotes SIRT1 expression and autophagy functions in astrocytes (±s, n = 3)

4 讨论

衰老细胞不同于凋亡细胞，具有广泛的代谢活性，但无增殖能力。自首次从体外培养非永生化成纤维细胞观察到“细胞复制性衰老”现象以来，至今对衰老大脑的广泛研究已经确定脑细胞的衰老是神经变性和认知能力下降的关键因素。研究证明，细胞衰老与阿尔茨海默病、帕金森病以及多发性硬化等多种神经退行性疾病的发生和发展有关[12-13]，研究报道，在阿尔茨海默病患者的额叶皮质中，衰老标志蛋白p16ink4a阳性的星形胶质细胞显著高于非阿尔茨海默病的同龄人[14]。另有研究报道，黄芪甲苷可通过促进有丝分裂自噬来抑制星形胶质细胞的衰老，从而改善帕金森病模型中的多巴胺能神经变性[15]，这些报道表明靶向星形胶质细胞的衰老可能是治疗或改善与年龄相关的神经退行性疾病的一种潜在的治疗方式。

β-半乳糖苷酶来源于GLB1基因编码的β-D-半乳糖苷酶，随着细胞的衰老，增殖能力下降，其数量和大小不断累积，其活性与衰老程度高度相关，在具有分化能力的细胞中无法检测到，因此β-半乳糖苷酶一直是体内外鉴定衰老细胞最广泛使用的生物标志物[16]。p53 蛋白是一种转录因子，在细胞应激反应中起着关键作用，在DNA 损伤时激活导致细胞生长停滞，指导细胞和机体的衰老。p21 是p53的下游基因，其表达受p53 调控，p21 可抑制细胞周期蛋白依赖激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）的活性，具有和细胞周期蛋白N端和C端结合位点以及增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的C端结合位点，可与CDK 复合物结合并抑制其活性，进而阻滞细胞周期[17]。Lamin B1 是一种核中间丝蛋白，在DNA 复制、有丝分裂纺锤体的形成、基因转录和细胞增殖的维持中起着至关重要的作用。Lamin B1 的下调是衰老后的关键介质，是局部染色质变化的触发因素，从而影响整体的基因表达[18]。D-半乳糖广泛用于体内外建立衰老模型，在本研究中，使用D-半乳糖诱导原代星形胶质细胞衰老，150 mmol/LD-半乳糖处理6 d 可成功构建细胞衰老模型，表现为β-半乳糖苷酶染色和衰老标志物p53、p21 蛋白表达增加，Lamin B1 蛋白表达下降，这些结果表明该条件可以成功诱导星形胶质细胞的衰老模型。GK 的干预可以抑制β-半乳糖苷酶染色和衰老标志物p53、p21 蛋白表达增加，促进Lamin B1 蛋白表达增加。Ki67 染色在临床上被广泛用作增殖指标，其在细胞分裂S 期、G2期和M 期积累，G1期和G0期即降解，因此Ki67 是细胞周期进行和静止期的分级标志物[19]。本研究结果显示，对照组和GK 组Ki67 表达显著多于模型组，表明正在进行分裂增殖的细胞明显多于模型组，GK 可促进细胞增殖。这些研究数据表明GK 可以在体外抑制由D-半乳糖诱导的原代星形胶质细胞的衰老，促进细胞增殖。

衰老相关分泌表型是衰老的细胞分泌细胞因子、趋化因子、细胞外基质蛋白酶等信号分子的总称。衰老的细胞分泌这些因子会改变局部组织微环境导致长期慢性炎症。这些因子不仅以自分泌的方式促进细胞自身的衰老，还以旁分泌的方式影响周围细胞的衰老[20]。衰老相关分泌表型可导致衰老相关炎症、代谢失调、慢性疾病、老年综合征和恢复力丧失等，减少衰老相关分泌表型的相关分泌也是临床的一种干预方式[21]。本研究发现，衰老的星形胶质细胞会增加TNF-α 的分泌，而GK 可以减少TNF-α 的分泌。其他细胞因子IL-6 和IL-1β 可能受限于体外培养，细胞含量少，细胞因子水平处于试剂盒检测下限，所以GK 也没能显示明显抑制作用。

BDNF 可以促进神经保护和神经再生，对神经元的营养支持作用是星形胶质细胞的功能之一。衰老的星胶分泌营养因子功能下降，而GK 可以促进BDNF 的分泌，恢复其部分功能。在帕金森病患者和动物模型中也发现其黑质纹状体通路中BDNF 水平下降，因此BDNF 可能可以作为一种治疗分子。但相关研究却表明外源性BDNF 直接送入大脑并不能缓解症状，且神经营养因子血脑通透性差、半衰期短、生物利用度差[22]，或许促进脑内星形胶质细胞分泌营养因子是一种更加行之有效的方法。

SIRT1 是一种NAD+依赖的去乙酰化酶，主要位于细胞核内，可以去乙酰化某些关键蛋白，从而调控衰老信号通路。据报道，SIRT1 可以去乙酰化非组蛋白底物p53，改变其转录活性，从而参与细胞衰老和生物体寿命的调节[23]。SIRT1 也被称为长寿调节因子，增加SIRT1 的表达可以延长多种生物的寿命，包括酵母、苍蝇、蠕虫和哺乳动物等[24]，而SIRT1 在体内的蛋白和转录水平会随着年龄的增加而下降[25]，同样，过表达小鼠大脑中SIRT1 水平可以显著延长小鼠的寿命[26]。进一步研究表明SIRT1 具有抗衰老的作用，可以促进机体或细胞年轻化，近年来，靶向SIRT1 来预防和治疗衰老相关疾病已经引起人们的注意。本研究发现GK 可以显著激活SIRT1 的表达，表明GK 的抗衰老作用可能与SIRT1 有关。

自噬是一种分解细胞内成分的过程，可降解和回收细胞中一些受损或不需要的成分，以维持能量稳态和保护细胞免受应激，自噬在发育和疾病的过程中起着至关重要的作用。近年来研究表明自噬激活与延长寿命之间存在正相关，在调节衰老中发挥着重要作用。卫星细胞随着年龄的增长，自噬现象消失，导致受损蛋白和细胞器累积，继而引发衰老和干细胞耗竭[27-28]。本研究发现衰老的星形胶质细胞LC3-Ⅱ/I 的表达减少，p62 表达增加。而GK 干预则可促进LC3-Ⅱ/I 的表达上升，p62 表达减少，LC3II 是自噬形成的前体物质，在衰老的星形胶质细胞中自噬被抑制，从而导致自噬底物标志物p62不能及时被降解而增多，而GK 可以促进星形胶质细胞的自噬现象，提示GK 可能通过促进自噬来抑制星形胶质细胞的衰老，但分子机制仍有待进一步深入研究加以阐明。另有相关研究报道，在衰老的细胞中，自噬系统被激活[29]，与本研究结果相反，这可能与细胞种类不同或不同的衰老模型有关。

综上，本研究发现GK 具有显著的抗衰老作用，能够促进星形胶质细胞的增殖和营养因子分泌，减少炎症因子TNF-α 的分泌，同时促进自噬和SIRT1表达。大量研究显示细胞的衰老是一个非常复杂的过程，是由诸多因素动态平衡紊乱导致的结局。GK介导的星形胶质细胞抗衰老作用可能通过上调SIRT1 表达，同时促进BDNF 产生和细胞自噬，多维度协同达到抗细胞衰老的效应。至于SIRT1 上调、BDNF 产生和细胞自噬相互间的关系，以及在GK抗衰老作用中的权重值得进一步利用现代细胞-分子生物学技术进行探索和验证。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突