大蒜热激转录因子基因AsHSFB1的克隆、亚细胞定位及其表达分析

杨青青　杨峰　赵永强　陆信娟　刘灿玉　葛洁　张碧薇　樊继德

摘要： 熱激转录因子（HSF）基因是植物热胁迫响应的重要转录调节基因，在植物胁迫应答和其他抗逆反应过程中起着关键作用。为研究大蒜热激反应的分子机制，本研究基于大蒜转录组数据，以徐蒜6号为试验材料，采用同源克隆方法获得编码HSF的AsHSFB1基因。序列分析结果显示，AsHSFB1含有882 bp的开放阅读框，编码293个氨基酸，其蛋白质含有热激转录因子的特征结构域。在进化关系上，AsHSFB1与拟南芥AT4G11660（AtHSFB2B）同源性最高。亚细胞定位结果表明，AsHSFB1蛋白主要定位在细胞核和细胞质上。本研究采用同源重组技术成功构建pCAMBIA1305-AsHSFB1过表达载体，为进一步研究该转录因子基因的功能，培育耐热大蒜品种奠定基础。RT-PCR分析结果表明，不同大蒜品种中，AsHSFB1基因在叶片中相对表达水平均最高，具有组织表达特异性；38 ℃高温胁迫处理下，徐蒜6号中的AsHSFB1基因相对表达水平在24 h时明显上调；4 ℃低温胁迫下，徐蒜815和徐蒜6号中AsHSFB1基因相对表达水平的变化趋势相似，均先上升后下降，在处理4 h时相对表达水平达到峰值。

关键词： 大蒜；AsHSFB1基因；同源重组技术；亚细胞定位；相对表达水平

中图分类号： S633.4 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2023）01-0169-09

Cloning， subcellular localization and expression analysis of garlic heat shock transcription factor gene AsHSFB1

YANG Qing-qing， YANG Feng， ZHAO Yong-qiang， LU Xin-juan， LIU Can-yu， GE Jie， ZHANG Bi-wei， FAN Ji-de

（Xuzhou Institute of Agricultural Sciences in Jiangsu Xuhuai Area， Xuzhou 221121， China）

Abstract：Heat shock transcription factor （HSF） is an important transcription regulation gene and plays a key role in plant stress response and other stress tolerance processes. In order to investigate the molecular mechanism of heat stress response in garlic， based on the transcriptome data of garlic， the experiment was conducted to obtain AsHSFB1 gene. This gene encoding HSF transcription factor was isolated by homologous cloning of Xusuan NO.6. Sequence analysis indicated that open reading frame （ORF） length of AsHSFB1 was 882 bp， encoding 293 amino acids. Its protein contained characteristic domain of heat shock transcription factor. Phylogenetic tree analysis result showed that AsHSFB1 was close to AT4G11660 （AtHSFB2B）. Subcellular localization results showed that AsHSFB1 was mainly localized in the nucleus and cytoplasm. In this study， overexpression vector pCAMBIA1305-AsHSFB1 was successfully constructed by homologous recombination technology， which provided a theoretical basis for the subsequent study on the function of AsHSFB1 gene and the cultivation of heat-resistant garlic varieties. RT-PCR analysis showed that the relative expression level of AsHSFB1 gene in garlic leaves was highest， indicating that it had tissue specificity. Compared with the control， the relative expression level of AsHSFB1 gene in Xusuan No.6 increased significantly at 24 h under 38 ℃ high temperature stress. Under 4 ℃ low temperature stress， the relative expression level of AsHSFB1 gene in Xusuan No.6 and Xusuan 815 showed a similar trend， which increased first and then decreased and reached the peak at 4 h.

Key words： garlic;AsHSFB1 gene;homologous recombination technology;subcellular localization;relative expression level

随着全球气候的变化，热胁迫已成为限制植物代谢和作物生产力的主要环境胁迫之一^[1-2]。热激反应是真核生物响应热胁迫广泛存在的保守进化反应，通常表现为停止正常的蛋白质合成和细胞活动以实现热激蛋白（HSP）的表达^[3-4]。热激转录因子（HSF）可以通过直接或间接调控一些应答基因的表达来调节植物对高温胁迫的响应^[5-6]。

HSF基因在植物中普遍存在，其数量、结构和调控过程远比动物体内的HSF复杂。目前根据序列相似性和寡聚化结构域的结构特征，可以将植物HSF基因家族成员划分Class A、Class B和Class C 3类^[7]。HSF结构一般由识别并结合热激元件（HSE）的N端DNA结合域、调控HSP转录的寡聚化结构域、核定位信号和核输出信号组成^[8]。Scharf等^[9]首次在番茄中克隆得到HSF基因。Mishra等^[10]对番茄植株进行高温处理，发现SlHsfA1基因的表达量显著增加。在拟南芥HSFA2基因的热胁迫研究中发现，该基因在高温胁迫下大量表达，可能主导了拟南芥的抗高温胁迫响应^[11]。Li等^[12]发现，玉米ZmHsf06基因可能在提高过表达拟南芥植株的耐高温、抗旱能力中发挥主要作用。在42 ℃高温处理下，不同时间段百合LlHSF1基因均有响应，证实该基因与百合的耐热性相关^[13]。此外，有研究发现，HSF转录因子还参与调控植物配子形成和根发育等过程^[14]。例如，在拟南芥和向日葵中，发现HsfA9与胚胎发育、种子形成有关^[15-16]。因而挖掘植物HSF相关基因，对植物耐热性分子机制与育种途径、耐热性生理基础等研究具有重要意义。

大蒜（Allium sativum L.）是具有医药作用的蔬菜作物，在世界范围内广泛种植^[17-18]。大蒜植株的耐寒能力较强，但不耐高温，是低温长日照作物，因此在栽培过程中，高温天气会严重影响大蒜的产量和品质^[19-20]。但目前关于大蒜中AsHSFB1的表达是否响应高温、低温胁迫的研究却鲜有报道。本研究拟对大蒜中AsHSFB1基因进行克隆，并进行生物信息学分析，研究其在特定温度下的表达特性，以期为进一步探索其功能提供依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料及其试验设计

以徐蒜6号、徐蒜815（江苏徐淮地区徐州农业科学研究所园艺研究室保存）为试验材料，选取已经解除休眠、饱满、无伤的鳞茎，播种于基质中，14 d之后将大蒜幼苗移栽到添加霍格兰氏（Hoagland）营养液的水培箱中。此外，选择生长一致、健壮的植株进行高温（38 ℃）、低温（4 ℃）胁迫处理。空气相对湿度设置为30%，每个处理重复3次。在处理0 h、4 h、8 h、24 h和48 h时取大蒜植株上部叶片，用液氮冷冻，并在-80 ℃条件下储存备用。

1.2 RNA提取和cDNA反转录

利用RNA提取试剂盒提取大蒜的RNA，并使用反转录试剂盒ReverTra Ace qPCR RT Master Mix将RNA反转录为cDNA，并将该cDNA用去离子水稀释15倍用于基因克隆。

1.3 AsHSFB1基因的扩增

根据课题组建立的大蒜转录组数据库，检索得到大蒜AsHSFB1基因序列。使用软件Primer Premier 6设计AsHSFB1基因全长引物，根据同源重组引物设计原则，选择Bam H Ⅰ、Hind III 2个限制性内切酶，设计克隆正向引物：5′-CGGGATCCCGATGACGCCAGCGGTCGAT-3′）和反向引物5′-CGAAGCTTCGTCACATTGCACTATGCTTTCTCCC-3′。程序设置為：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共34个循环；72 ℃延伸10 min。回收PCR目的条带。本研究所有引物合成、测序工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.4 利用同源重组法构建大蒜AsHSFB1基因表达载体

利用Bam H Ⅰ、Hind III 2个内切酶对pCAMBIA1305载体进行双酶切，获得线性化的载体，将含有酶切位点的目的片段重组到pCAMBIA1305空载体上，转化到大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆测序。

1.5 大蒜AsHSFB1基因的生物信息学分析

不同植物的HSFB1氨基酸序列比对利用DNAMAN 6.0软件完成；运用ExPASy蛋白质组分析工具中的Prot-Param（http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）分析蛋白质的基本性质；利用CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）预测大蒜AsHSFB1氨基酸保守域；用SOPMA软件对大蒜AsHSFB1蛋白进行二级结构预测及分析；利用MEGA 5.0软件以Neighbor-Joining算法构建系统发育树^[21]；运用plantCARE在线分析工具分析AsHSFB1启动子。

1.6 AsHSFB1蛋白的亚细胞定位

利用基因和载体的序列设计、重组新的引物，对去掉终止密码子的AsHSFB1基因进行扩增。选取Bsa Ⅰ/Eco31 Ⅰ酶切位点，设计特异性引物（正向引物5′-CAGTCGTCTCACAACATGACGCCAGCGGTCGATTCAC-3′，反向引物5′-CAGTCGTCTCATACACATTGCACTATGCTTTCTCCCCAACGG-3′）来扩增AsHSFB1基因，切胶回收PCR产物检测无误后与线性化载体pBWA（V）HS-GFP进行连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α，挑取阳性单克隆进行测序验证后，即获得重组质粒pBWA（V）HS-AsHSFB1-GFP，利用电击法将其重组融合表达载体pBWA（V）HS-AsHSFB1-GFP导入农杆菌GV3101。通过悬浮农杆菌、收集菌体，再经过重悬后，用1 ml注射器分别将含有绿色荧光蛋白（GFP）和pBWA（V）HS-AsHSFB1-GFP的缓冲液注射到30 d左右苗龄烟草的叶片背面，将侵染后的烟草弱光培养48 h后使用激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位情况。

1.7 RT-qPCR分析

使用Primer Premier 6软件设计AsHSFB1基因的RT-qPCR定量引物（正向引物：5′-CAGCAGCAGTGACAGTAG-3′，反向引物：5′-CTTGGACATAAGCGAGTAGA-3′）。选择SNAD基因作为大蒜内参基因（BD-SAND-F：5′-GCGTCAACGAATGTTCCAATTACCA-3′，BD-SAND-R：5′-TCTCTTCAGTCTCAACTTCATCAGCAT-3′）。通过IQTM5 Real-time PCR System完成RT-qPCR检测。基因相对表达水平的计算采用2^-△△Ct法^[22]。

2 结果与分析

2.1 大蒜AsHSFB1基因的克隆及其编码的蛋白质理化性质的分析

以徐蒜6号未经胁迫处理叶片的cDNA为模板进行扩增，得到1个长约800 bp的目的片段（图1）。测序结果显示AsHSFB1基因含有1个长度为882 bp的开放阅读框，编码293个氨基酸。NCBI BlastP结果显示，AsHSFB1屬于HSF家族成员。

通过ExPaSy-ProtParam预测显示AsHSFB1蛋白的分子式为C₁363H₂170N₃88O₄47S₁1，相对分子质量为3.149×104，理论等电点（pI）为6.76，带正电荷的残基总数[精氨酸（Arg）+赖氨酸（Lys）]为33个，带负电荷的残基总数[天冬氨酸（Asp）+谷氨酸（Glu）]为33个；不稳定系数为53.37，说明AsHSFB1蛋白属于不稳定蛋白质；AsHSFB1蛋白富含丝氨酸（Ser，14.7%）、甘氨酸（Gly，8.2%）、亮氨酸（Leu，7.5%）（图2）。AsHSFB1蛋白的二级结构主要由螺旋（33.11%）、延伸结构（12.36%）、转角（4.1%）和无规则卷曲（50.17%）构成。

2.2 大蒜AsHSFB1基因相关生物信息学分析

2.2.1 保守域结构预测 通过NCBI CDS对徐蒜6号中AsHSFB1蛋白的保守域进行预测，结果（图3）表明，AsHSFB1的第14位至第106位氨基酸间含有HSF-DNA结构域，属于HSF家族。

2.2.2 同源性比对分析 将大蒜AsHSFB1与NCBI数据库中水仙（Narcissus tazetta，登录号：QBC36000.1）、薯蓣（Dioscorea cayenensis，登录号：QBC36000.1）、杨梅（Morella rubra，登录号：KAB1210726.1）、金杜鹃（Rhodamnia argentea，登录号：XP_030536717.1）和猕猴桃（Actinidia chinensis，登录号：PSR93425.1）5种植物的HSFB1氨基酸序列通过DNAMAN 6.0进行序列比对，结果（图4）表明，大蒜AsHSFB1氨基酸序列与水仙、金杜鹃的HSFB1氨基酸序列的一致性较高，说明HSFB1具有较高的保守性。

2.2.3 亲水性/疏水性分析 对大蒜的AsHSFB1蛋白进行疏水性/亲水性预测，结果（图5）表明，该蛋白质的亲水性平均系数（GRAVY）为-0.502，具有较强的亲水性，属于亲水性蛋白质。

2.2.4 AsHSFB1进化树的分析 通过MEGA 5.0软件对大蒜AsHSFB1与拟南芥HSF家族进行同源性分析。图6显示，AsHSFB1与AT4G11660、AT5G62020.1、AT2G41690进化距离最近，且属于同一分支。AsHSFB1与AT4G11660（AtHSFB2B）的同源性最高，其次与AT5G62020.1（AtHSFB2A）类热激转录因子的同源性也比较高，因此，大蒜AsHSFB1属于HSFB亚家族成员。

2.2.5 AsHSFB1启动子的生物信息学分析 利用PlantCARE启动子预测元件分析AsHSFB1启动子的顺式调节元件，并列出11种常见的元件（图7、表1），这些元件包括厌氧诱导必需的顺式作用调节元件ARE，赤霉素响应元件GARE-motif，参与MeJA反应的顺式调控元件CGTCA-motif，参与脱落酸反应的顺式作用元件ABRE，核心启动子元件TATA-box，蛋白质结合位点HD-Zip3，启动子增强的顺式调节元件CAAT-box以及4个光响应元件（Box 4、G-Box、Gap-box和ACE）。

2.3 基于同源重组克隆技术构建大蒜AsHSFB1表达载体

将重组得到pCAMBIA1305-AsHSFB1质粒进行酶切鉴定，能够切出大小为800 bp左右的片段（图8），说明成功构建了pCAMBIA1305-AsHSFB1植物过表达载体（图9）。

不同颜色的片段是推定的元素序列。

2.4 大蒜AsHSFB1蛋白亚细胞定位

为明确AsHSFB1在细胞中的位置，以GFP空载体为阳性对照，在本氏烟草中进行亚细胞定位测定。图10显示，细胞核及细胞质上均有荧光信号，说明AsHSFB1蛋白主要定位在细胞核和细胞质中。

2.5 AsHSFB1基因在不同组织中、不同温度处理下的表达

RT-qPCR分析结果（图11）表明，徐蒜815、徐蒜6号AsHSFB1基因在叶片中的相对表达水平均表现为显著高于其在根和鳞茎中的相对表达水平，而根和鳞茎间AsHSFB1基因的相对表达水平差异不显著。

图12显示，38 ℃高温处理下，徐蒜815中AsHSFB1相对表达水平在高温处理4 h、24 h时与0 h（对照）相比显著升高，在处理24 h时达到峰值，是对照的12.48倍；徐蒜6号中AsHSFB1相对表达水平在高温处理24 h时达到最高，是对照的17.82倍。4 ℃低温处理下，随着处理时间的增长，徐蒜815和徐蒜6号中AsHSFB1基因的相对表达水平均呈现先升高后下降的趋势，并且均在处理4 h和48 h分别达到最高和最低。

3 讨论

在热激反应中HSF作为关键调控因子，主要通过调控下游热激蛋白基因以及耐热性相关基因的表达来发挥抗逆作用^[23-24]。当植物遭受高温胁迫时，HSF不再以单体的形式存在于细胞质中，而是形成特殊结构三聚体进入细胞核，通过特异性识别启动子区的热激元件来激活热激基因转录，进而生成HSP来抵抗高温胁迫^[25-26]。本研究从大蒜品种徐蒜6号中克隆得到AsHSFB1基因，保守结构域分析结果表明AsHSFB1属于HSF家族，具有典型的HSF-DNA结构域。通过多重序列比对分析，发现大蒜AsHSFB1氨基酸序列与水仙、金杜鹃HSFB1氨基酸序列的一致性较高，表明HSFBL具有较高的保守性。大蒜AsHSFB1与拟南芥HSF家族成员构建的進化树显示，大蒜AsHSFB1属于HSFB亚家族成员。RT-qPCR结果显示：不同大蒜品种中AsHSFB1基因对38 ℃高温和4 ℃低温2种逆境环境均有响应。对大蒜AsHSFB1基因表达特性进行深入研究，发现不同品种大蒜AsHSFB1基因在不同组织（根、鳞茎、叶片）中均有表达且具有组织表达特异性，在叶片中的相对表达水平最高。

目前，关于植物中HSF家族B亚族的研究并不多。在番茄中，HSFB1作为协同激活因子，与HSFA家族成员共同参与对高温胁迫的调节^[27]。拟南芥中过表达鹰嘴豆CarHSFB2基因增强了拟南芥的耐热性^[28]。拟南芥中的HSFB2a、HSFB2b可以通过与HSFA1a、HSFA1b结合，从而提高拟南芥的耐热性，属于热诱导型转录因子^[29]。由于大蒜AsHSFB1是HSFB亚家族成员，而B亚家族成员不含芳香族-疏水-酸性氨基酸尾巴（AHA）序列，因此大蒜AsHSFB1基因可能是通过与HSFA类基因的协同作用来增强植株的抗热能力。在魔芋^[30]和香石竹^[31]中都成功克隆到HSFB1基因，发现魔芋AaHSFB1和香石竹DcHSFB1蛋白N端均有典型的DBD结构域，这一点与大蒜AsHSFB1蛋白N端也具有DBD结构域的结果一致，并且大蒜AsHSFB1与来源于其他物种的HSFB1均存在HSF保守结构域。HSFB基因的表达存在物种、组织的差异，芹菜品种津南实芹中AgHSFB2基因在叶片和根中的相对表达水平明显高于茎^[32]。魔芋AaHSFB1基因在球茎中的表达量低于根和叶片^[30]。在本研究中，大蒜AsHSFB1基因在叶片中的相对表达水平显著高于根和鳞茎。

通过对大蒜幼苗进行高温、低温逆境胁迫处理，在不同的处理时间（0 h、4 h、8 h、24 h和48 h）进行取样，可以较为深入地研究温度对大蒜AsHSFB1表达模式的影响。结果表明：38 ℃高温胁迫处理下，徐蒜815和徐蒜6号中AsHSFB1基因均能响应热胁迫，并且都在处理24 h时相对表达水平达到最高；4 ℃低温处理时，在大蒜幼苗经历低温的48 h之内，徐蒜815和徐蒜6号中AsHSFB1基因相对表达水平总体呈现先升高后下降的趋势，均在低温胁迫4 h时达到峰值，随后开始下降。AsHSFB1基因在相同温度处理下表现出品种的差异，38 ℃高温处理下，徐蒜6号中AsHSFB1基因的相对表达水平总体高于徐蒜815。综上所述，大蒜热激转录因子基因AsHSFB1可能参与其对高温、低温逆境的响应过程，但作用机制还需要进一步研究。

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（责任编辑：王 妮）