微滴式数字PCR技术定量检测发酵乳中醋化醋杆菌

张雅伦，王 赞，张 瑞，陈勃旭，周 巍*，张 岩*

（河北省食品检验研究院，河北省食品安全重点实验室，国家市场监管重点实验室（特殊食品监管技术），特殊食品安全与健康河北省工程研究中心，河北 石家庄 050227）

发酵乳因含有丰富的蛋白质、糖类等多种营养物质，备受人们喜爱[1-4]，但发酵乳因其产品独特条件限制，极易在制备流程、流通过程、贮藏环境等中受到其他因素影响而导致产品质量下降，其中微生物污染对其带来的影响最为严重且难以控制[5-7]。醋化醋杆菌常被发现于腐烂的水果和产酸的食品中，其导致食品变质酸败的作用也逐渐为人熟知[8]。醋化醋杆菌同时也会造成发酵乳的污染，使其益生菌群结构改变，在酸乳表面形成菌膜，产生胀包和酸涩味等不良现象[9]。当今发酵乳等乳制品的质量和安全问题受到人们广泛关注，一旦受微生物污染的发酵乳流入市场，不但会对生产企业声誉造成损害，带来经济效益的巨大损失，还会对消费者的身体健康造成影响，危及生命安全。因此，不同环节的精准、定量掌控发酵乳中的污染情况，对发酵乳的质量至关重要[10-11]。

2.2 家系Ⅱ 检出致病基因为CDH23基因的c.7240-1G>A和c.7252G>A两个位点复合杂合突变；2名耳聋患者(Ⅱ2、Ⅱ3)视力、视野、眼底检查未见异常。CDH23基因c.7252G>A位点突变为国内首报新突变位点，结果、家系图及测序突变。见表1、表2、图1、图2。

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术自发明以来，已被广泛应用于微生物检验，推动了检验领域快速发展。第1代普通PCR技术通过凝胶电泳方式进行分析，但只能用于样品定性检验和半定量研究[12-17]。第2代荧光PCR技术通过反应体系荧光信号进行分析，虽然与第1代技术相比提升了检验速度，减少了非特异性扩增，增加了精准性，但其定量计算是相对的，受到很大应用限制，不能达到定量分析要求[18-21]。随着定量分析需求日益增加，第3代数字PCR技术应运而生。微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技术和荧光PCR技术相比具有高灵敏度、高精确度、高耐受性、绝对定量等特性，可以将一个传统PCR反应激发成数万个独立PCR反应，极大降低了其他因素影响，并且ddPCR方法无需依靠标准曲线和循环阈（cycle threshold，Ct）值，直接计算出样品的拷贝数，从而达到精准定量[22]。基于以上特点，ddPCR方法能够满足精准定量检测发酵乳中醋化醋杆菌的需求，该方法具有广泛应用前景[23-25]。

本研究基于ddPCR技术建立发酵乳中醋化醋杆菌的检测方法，并对其反应条件进行优化，对其特异性和灵敏度进行验证，采用定量方法进行计算，为发酵乳中污染菌的定量检测提供一定的理论依据，为发酵乳生产企业的过程把控提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

发酵乳购于当地超市，实验用菌株来自于有编号保存菌株，见表1。

表1 实验用菌株Table 1 Strains used in the study

2×ddPCR技术探针检测法混匀体系、微滴专用激发油和专用分析油 美国Bio-Rad公司；正向（反向）引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒（磁珠式）、Reagent D 德国Biotecon Diagnostics公司；营养肉汤培养基、醋酸菌培养基、乳杆菌培养基、弯曲菌培养基、MRS培养基、双歧杆菌培养基、脑心浸液培养基、3.5%氯化钠肉汤培养基、牛肉膏微量元素培养基 北京陆桥技术有限责任公司。

3.综上所述，提高湿地保护科学性，还要加大湿地保护投入，创新湿地保护载体，注重法制化的开展湿地保护相关工作，在标准化与规范化的原则下建立完善的湿地保护框架，从而系统化的解决湿地保护中的现实问题。

1.2 仪器与设备

QX200 ddPCR检测分析系统（包括微滴激发生成仪、微滴检测分析仪、DG8 cartridge微滴生成卡）、C1000 Touch Thermal Cycler PCR基因扩增设备 美国Bio-Rad公司；NanoDrop Lite核酸测定仪、711基因组全自动提取仪 美国Thermo公司；DK-98-1恒温水浴锅东方电工仪器厂；BHC-300IIA/B3生物安全检验柜 苏州净化仪器设备有限公司；3K15台式高速离心机 美国Sigma公司。

1.3 方法

将市售发酵乳进行121 ℃、30 min高压灭菌，无菌操作进行醋化醋杆菌人工污染，分别将其按照不同浓度梯度添加到发酵乳中，使其含量维持在101～107CFU/g，并通过上述方法进行基因组DNA提取和ddPCR法检测，得出该方法的检出限。

1.3.1.1 Reagent D处理细菌培养液

对试题的知识点分布明细统计可反映命题决策者对考试大纲标准的理解和判断.实际对7套真题中知识点分布明细统计，发现：

在小区门前，杜一朵碰见了一个熟人。熟人问她一大早忙什么去？杜一朵随口说，打牌去。都晓得杜一朵爱打牌，且打得一手好牌。熟人也没多想，点点头就过去了。后来熟人又遇见一个熟人，熟人惯性地问，你也打牌去？那人两眼通红大着嗓门说，清晨八早打个屁！打炮！

1.3.1.2 FoodProof磁珠提取法

ddPCR反应体系：2×ddPCR探针混匀体系10 μL、1.2 μL正向和反向引物及0.4 μL探针（浓度均为10 μmol/L），加入4.4 μL样品DNA，使用ddH2O将体系补至20 μL。将反应体系充分混匀转移到微滴发生板中，并加入70 μL微滴专用激发油后放到微滴发生器中进行激发。将生成的微滴通过PCR反应，初始条件：95 ℃、10 min，94 ℃、1 min，58 ℃、45 s，共计40 次循环；98 ℃、10 min。PCR反应结束后放入QX200 Droplet Reader采集荧光信号，最终通过微滴QuantaSoft分析软件计算得出结果。

将传代培养3 次的菌株培养液充分混匀，吸取100 μL增菌液和400 μL Reagent D到2 mL无菌离心管中，在室温条件下避光静置5 min；在500 W卤素灯下方15～20 cm处放置离心管，曝光5 min后，8 000 r/min离心5 min，去除上清液；加入100 μL无菌水充分混匀，用于后续DNA提取。

1.3.2 醋化醋杆菌特异性引物设计

通过分析醋化醋杆菌的基因序列，从GenBank数据库中选取保守性强且特异性强的基因序列，最终选定醋化醋杆菌ITS基因为靶标序列，通过Primer Premier 6.0软件设计相关引物序列，并通过Oligo 7.37进行验证，经实验后获得醋化醋杆菌特异性检测引物，如表2所示。

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