Asp基因对急性心肌梗死小鼠心功能及Erk1/2表达的影响

吕茂琳，王存吉，热洋尼沙·卡的，高 颖

新疆医科大学第一附属医院 综合内三科，新疆 乌鲁木齐 830054

冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease,CHD)由多种危险因素所致,包括年龄、性别、血脂异常、肥胖、高血压、糖尿病和吸烟等[1-2]。每年约740万人死于CHD,其中,急性心肌梗死的患者在全世界接近300万人[3-4]。

促酰化蛋白(acylation stimulating protein,Asp)是由脂肪细胞合成的脂肪因子,因其刺激脂质储存,在脂质代谢中发挥重要作用[5]。Asp通路代谢失调可导致肥胖及心血管疾病[6]。Asp可激活细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,Erk)[7],激活的后者可以保护心脏免受再灌注损伤[8]。本研究用Asp-/-小鼠及野生型小鼠构建心肌梗死模型,探讨Asp在急性心肌梗死中的作用及其机制。为个体化的诊断和基因治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物: SPF级雄性C57BL/6小鼠10只、Asp 敲除纯合子(Asp-/-)C57BL/6小鼠10只,8周龄,体质量20～25 g[来源单位:上海南方模式动物研究中心;合格证号SYXK(沪)2017-0012]。

1.1.2 试剂(盒):10×电泳转移缓冲液(转膜液)及5×电泳缓冲液选自北京索莱宝科技有限公司。总胆固醇(TC)测定试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测定试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测定试剂盒、三酰甘油(TG)测定试剂盒、IL-8测定试剂盒及eNOS测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。Erk1/2及p-Erk1/2抗体(Cell Signaling Technology试剂公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分组及处理:将C57BL/6和Asp-/-小鼠分别分为对照组和MI组(结扎冠状动脉前降支),每组5只。结扎心脏区域周围的心肌颜色变深,运动减弱,说明造模成功。24 h后开胸留取心脏及血液。

国内农业需求冷清；工业方面，环保压力较大，复合肥和胶板企业开工率保持低位，对尿素随用随采，需求较少。出口方面，虽印度展开招标，但国际供给充足，价格下跌，对国内市场难形成利好支撑。供给方面，煤炭、天然气进入供暖需求旺季，价格有所上涨，成本上对尿素价格支撑较强，开工率预计将保持低位或进一步下跌。综上预计，近期尿素价格或将高位持稳，需关注环保形势和冬储进展情况。

1.2.4 伊文思蓝-TTC染色:2% 伊文思蓝染色及TTC染色后,观察各组MI术后小鼠白色梗死区、红色缺血区及蓝色存活区面积。

1.2.6 Western blot检测 Erk1/2和p-Erk1/2的表达:造模后24 h取结扎线以下左心室心肌,研磨并提取心肌组织,制备蛋白样品,每孔上样后,置于电泳缓冲液中电泳90 min,分离目的蛋白,电转2 h,5%奶粉封闭1 h后,Erkl/2及p-Erkl/2和GAPDH一抗置于4 ℃冰箱内孵育过夜,TBST洗膜3次后,山羊抗兔二抗室温孵育1 h,TBST缓冲液洗膜3次,ECL显色、曝光、扫描、吸光度分析。

1.2.2 空腹体质量及血糖的检测:非麻醉状态下鼠尾采血,罗氏血糖仪监测小鼠禁食8 h后的血糖值,小鼠处死前称空腹体质量。

Asp-/-+MI术后组与C57+MI术后组心肌伊文思蓝-TTC染色相比,白色染区增多,红色及蓝色染区减少(图3)。

1.2.3 心脏超声:术后24 h后,采用M型超声检测小鼠连续5次的心动周期,取均值。计算左心室舒张末内径(LVEDd)、左心室收缩末内径(LVESd)、射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)。

1.3 统计学分析

MI造模后的C57野生型小鼠与Asp-/-小鼠IL-8均高于术前水平,且Asp-/-MI术后IL-8水平较C57+MI升高(P<0.05)。两组术后的eNOS含量较术前明显降低(P<0.05)(图4A)。与C57野生型小鼠相比,在相同饮食条件下Asp-/-小鼠血清LDL-C、HDL-C及TC与C57野生型小鼠无明显差异,TG较C57野生型小鼠明显升高(P<0.05)(图4B)。

2 结果

2.1 小鼠体质量和血糖

Asp-/-组小鼠的体质量及空腹血糖较C57组小鼠明显增加(P<0.05)。Asp-/-+MI术后的空腹血糖及体质量较C57+MI组小鼠也明显升高(P<0.05)(图1)。

《母婴安全行动计划（2018－2020年）》提出，到2020年全国孕产妇死亡率下降到18/10万，全国婴儿死亡率下降到7.5‰。该计划提出，开展妊娠风险防范、危急重症救治、质量安全提升、专科能力建设、便民优质服务等5大行动。

*P<0.05 compared with C57.图1 各组小鼠体质量及空腹血糖的变化分析Fig 1 Weight and fasting blood glucose level in different

2.2 超声对各组小鼠心脏结构和功能的影响

与C57+MI手术组相比,Asp-/-+MI组LVEDd、LVESd、FS及EF均有明显改变(P<0.05)。Asp-/-+MI组的左室收缩末径及左室舒张末径均明显高于C57+MI手术组,短轴缩短率及射血分数明显低于C57+MI手术组小鼠(图2)。

*P<0.05 compared with C57.图2 各组小鼠心脏超声检测结果Fig 2 The results of echocardiography of mice in each group

2.3 伊文思蓝-TTC染色检测小鼠缺血心肌面积

1.2.5 ELISA检测小鼠血清血脂谱、IL-8及eNOS:取小鼠下腔静脉血液1 mL,4 ℃ 1 500 r/min离心15 min之后,取出上清液至离心管中备用。采用TC、TG、LDL-C、HDL-C、IL-8和eNOS ELISA试剂盒测定含量或活性。

Myocardium of Asp-/-+MI group and C57+MI group were stained with Evans blue-TTC; white stained areas was larger, indicating that the area of myocardial infarction in Asp-/- mice was larger.The area of viable myocardium and ischemic myocardium was smaller than that of C57+MI.图3 心梗术后心肌染色结果Fig 3 Myocardial staining results after myocardial infarction

2.4 心肌IL-8、eNOS及血脂谱变化

*P<0.05 compared with non-MI or C57; #P<0.05 compared with C57+MI.图4 各组小鼠心肌IL-8、eNOS及血脂谱的变化Fig 4 Changes of IL-8, eNOS and lipid profile in myocardium of each

2.5 心肌Erk1/2和p-Erk1/2的表达

C57及Asp-/-组心肌Erk1/2及p-Erk1/2的表达无显著差异。MI后,Asp-/-+MI组Erk1/2及p-Erk1/2表达较C57+MI组明显减弱(P<0.05)。Asp-/-+MI组Erk1/2及p-Erk1/2表达较Asp-/-基因敲除组明显减弱(P<0.05)(图5)。

有意见则认为闪族语系是后来分成语支的。这里有两个疑点：第一，语言分支的产生；第二，巴比伦国与巴别塔建造的先后。

*P<0.05 compared with Asp-/- non-MI; #P<0.05 compared with C57+MI.图5 心肌组织中Erk1/2、p-Erk1/2蛋白表达Fig 5 The protein expression of Erk1/2 and p-Erk1/2 in myocardium

3 讨论

脂肪组织是一个具有代谢、内分泌和免疫功能的器官,可影响多种生理过程[9]。Asp作为强刺激因子可促进脂肪酸酯化和三酰甘油合成。故Asp与肥胖、动脉粥样硬化密切相关[10]。本研究提示Asp基因敲除小鼠的体质量和空腹血糖均高于野生型小鼠,且体型明显大于野生型小鼠,说明当Asp基因缺失时,小鼠体内的糖和脂代谢受到影响。Asp基因敲除小鼠血清的TG明显高于野生型小鼠,进一步说明Asp可影响脂代谢,从而可能影响心血管功能。

有报道在心肌梗死患者的血液和动脉粥样硬化斑块中发现了包括 C3 在内的活化补体副产物水平的改变[11],Asp是C3裂解物。本研究发现,Asp-/-+MI小鼠的左室收缩末径与左室舒张末径均明显高于C57+MI小鼠,短轴缩短率及射血分数明显低于C57+MI小鼠,说明在MI发生后,Asp敲除小鼠的心功能较野生型MI小鼠明显降低;提示Asp对小鼠心肌的保护作用。

考虑到两电平逆变器存在8个电压矢量,在价值函数优化过程中,需要对这8个电压矢量进行优化求解,这使得优化求解过程的计算量显著增加.为了降低优化求解的计算量,本工作设计了一种优化矢量选择器,通过定子磁链的给定值求得给定的电压矢量,使得在价值函数优化过程中只需对给定电压矢量所在扇区的3个电压矢量进行优化求解即可,有效降低了优化求解的计算量.下面对优化矢量选择器的设计过程进行详细描述.

1．2．2 心理健康评定 采用中学生《心理健康诊断综合测量》（MHT）［7］，该表是我国心理工作者据日本铃木清等编制的《不安倾向诊断测验》，参考我国学生实际情况修订而成，其折半信度为0．83～0．88，重测信度为0．663～0．870，效度＞0．76。含8个内容量表和1个效度量表。8个内容量表是学习焦虑、对人焦虑、孤独倾向、自责倾向、过敏倾向、身体症状、恐怖倾向、冲动倾向等。分量表分高于8分视为有焦虑倾向；8个内容量表原始分之和查表得出总焦虑倾向标准分，在65分以上，为高焦虑水平，视为存在心理问题。

两组治疗总有效率[2] 。疗效判定标准：显效：治疗后，咳嗽、咳痰、喘息等临床症状和体征基本消失，经实验室检查可见炎性病灶基本吸收；有效：各项临床症状和体征得到明显缓解，炎性病灶控制良好；无效：临床症状和身体体征均未出现明显变化，炎性病灶未被吸收，或病情出现严重化趋势。治疗总有效率=显效率+有效率。

在MI手术后,Asp-/-小鼠心肌梗死的面积更大,而存活心肌和缺血心肌的面积较野生型减少,进一步说明了Asp基因在小鼠MI中发挥着重要作用。C57+MI组小鼠的Erk1/2及p-Erk1/2的表达较Asp-/-组明显增强,说明Asp基因可通过Erk1/2信号通路影响小鼠心功能。

本研究发现Asp通过激活Erk1/2信号通路来减轻小鼠的心肌损伤,此结果为临床治疗心肌梗死所致的心肌损伤提供了新的思路和新靶点。