QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定生姜中多种农药及代谢物残留

张金环，程艳宇，李桂红，李伟霞，朱欢

(天津市乳品食品监测中心有限公司，天津 300392)

姜是一种药用和食用植物[1]，由于其日益凸显的经济价值，种植面积迅速扩张。我国是世界上生姜种植面积最大和产量最高的国家，生姜年产量已达到1 000 万t，约占世界总产量45%。生姜在生长和贮存期间，通常会使用农药来防治害虫和病害[2]，因此，姜中农药残留的检测尤为重要。

生姜中农药残留检测方法主要有气相色谱法(GC)[3-4]、液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)[5-7]、液相色谱法-串联质谱法(LC-MS/MS)[8-10]以及高分辨质谱法(Q-TOFMS)[11-14]等。GC、LC 方法与色谱-质谱联用方法相比，不但存在定性能力不足，而且一次性可检测的农药种类也有局限性。Q-TOFMS 可采集更为全面的化合物信息，定性优势突出，但所需仪器价格过于昂贵。液相色谱-串联质谱法是一种广泛应用于农产品中农药残留检测方法，具有高灵敏度、高选择性、高回收率和高通量等优点。农药残留检测样品前处理技术主要包括传统的液液萃取、固相萃取[15]、基质固相分散萃取、固相微萃取[8]以及QuEChERS[9-12,16]等。

为减少传统QuEChERS[16-17]方法的基质效应，提高其回收率，拟通过优化提取溶剂和净化方法，选择乙腈为提取剂，基于超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)对姜中农药及代谢物残留进行快速检测分析，为农药残留提供一种快速、准确、灵敏的分析方法，为食品安全风险监测工作提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

生姜(天津地区市售)；农药及代谢物标准品：哒螨灵，嘧菌酯，辛硫磷，虫酰肼，吡唑醚菌酯，多菌灵，啶虫脒，甲氨基阿维菌素苯甲酸盐，霜霉威，咪鲜胺，灭蝇胺，氯虫苯甲酰胺，多效唑，氟啶脲，烯酰吗啉，噻虫嗪，吡虫啉，氯吡脲，克百威及其代谢物3-羟基克百威、涕灭威及其代谢物涕灭威砜、涕灭威亚砜，甲萘威，灭多威，氧乐果，抗蚜威，乐果，甲霜灵，嘧霉胺，噻虫胺，氟硅唑，氯唑磷，戊唑醇，三唑酮，啶酰菌胺，毒死蜱，噻嗪酮，茚虫威，灭幼脲，氟虫腈及其代谢物氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈亚砜(天津阿尔塔)；甲醇、乙腈(色谱纯，默克)；乙酸铵(德国SIGMA 公司)；氯化钠(分析纯)；所有用水均为超纯水；0.22 μm 有机相滤膜。吸附剂：十八烷基键合硅胶(C18：43~60 μm)、N-丙基乙二胺键合硅胶(PSA：40~60 μm)、GCB(40~120 μm)(CNW，中国)

SCIEX 三重四极杆质谱联用仪配Waters I Class超高效液相色谱；IKA T25 数显型分散机(德国IKA公司)。

1.2 标准溶液配制

1.2.1 标准储备溶液(100 μg/mL)配制

准确移取1.0mL 农药或代谢物标准品(1000μg/mL)，用甲醇溶解并定容至10 mL，避光-18 ℃以下保存。

1.2.2 混合标准溶液(1.00 μg/mL)配制

移取一定量农药或代谢物标准储备溶液于容量瓶中用甲醇定容至刻度，避光-18 ℃以下保存。

1.3 样品前处理

准确称取10.0 g(精确至0.01 g)姜试样于50 mL塑料离心管中，加入20 mL 乙腈，10 000 r/min 均质提取1.0 min。向匀浆后的样品中加入5 g 氯化钠，于5 000 r/min 离心提取5 min，取2 mL 上清液置于装有150 mg 无水硫酸镁、25 mg PSA 和2.5 mg GCB的离心管中，涡旋1 min，于5 000 r/min 离心提取5 min，上清液经0.22 μm 滤膜过滤，测定备用。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色谱柱；流动相：A 相：含0.1%甲酸的5 mmol/L 乙酸铵溶液，B 相：乙腈，流动相梯度洗脱程序见表1；流速：0.3 mL/min；进样量：2 μL，柱温：40 ℃；分析时间：8 min。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：正负切换模式；检测方式：多反应监测(MRM)；气帘气及流量：氮气，35.0 μL/min；GS1 及流量：氮气，55 μL/min；GS2 及流量：氮气，55 μL/min。

2 结果与分析

2.1 仪器参数

将200 ng/mL 每种农药或代谢物标准品分别由针泵直接注入质谱，优化MRM 离子对。全扫描模式下(m/z50~1 000)进行母离子扫描。针对母离子，测试并优化去簇电压(DP)。选择优化后母离子在MRM 模式下扫描产物离子，分别为每种化合物选择2 个子离子，同时优化子离子的碰撞电压(CE)。定量和定性离子、去簇电压和碰撞能量等参数见表2。

2.2 色谱条件

选择性能优异、稳定性好、载样量和分离度高的Waters ACQUITY UPLC BEH C18超高效液相色谱柱，并比较了色谱柱50、100 mm 2 种长度对分离效果的影响。结果表明各农药及代谢物在ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色谱柱上保留时间和分离度均比较理想。

甲醇和乙腈是常用的2 种有机流动相，基于乙腈黏度较小、系统压力低、分离度好，选择并比较了反相色谱常用的流动相体系乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-5 mmol/L 乙酸铵水溶液和乙腈-0.1%甲酸的5 mmol/L 乙酸铵水溶液。乙酸铵能促进化合物的离子化效率，且加入甲酸利于目标化合物响应增强、峰形变尖锐、灵敏度变高。结果表明，以乙腈-含0.1%甲酸的5 mmol/L 乙酸铵水溶液为梯度洗脱流动相，各农药及代谢物峰形良好、响应值高。

2.3 提取溶剂

考察了乙腈、乙酸乙酯和甲醇3 种提取溶剂对各农药及代谢物在姜空白基质中加标100 μg/kg 回收率的影响。结果表明：乙腈为提取剂时，它们的回收率为85%~103%，符合GB/T 27404—2008 附录F中对回收率范围的要求(被测组分含量为0.1~1.0 mg/kg时，回收率范围为80%~110%)；乙酸乙酯为提取剂时，哒螨灵和灭蝇胺回收率分别为73%和62%；甲醇为提取剂时，各农药及代谢物回收率为64%~129%，不符合GB/T 27404—2008 附录F 中对回收率范围的要求。因此，选择乙腈作为提取剂。

2.4 吸附剂

QuEChERS 是通过填料与样品基质干扰物质相互作用吸附杂质，达到净化除杂质目的。常用吸附剂有PSA(N-丙基乙二胺)、C18(十八烷基硅胶键合相)、石墨化碳黑(GCB)、无水硫酸镁等。PSA 为反相固定相或阴离子交换固定相，能有效去除提取液中极性物质，如有机酸、糖类等碳水化合物，但PSA的过量使用会使具有-NH2、-OH、-SH 等官能团农药被吸附，检测结果偏低；C18可以有效去除姜提取液中脂类物质，如脂肪、甾醇和挥发性油；GCB 主要用于去除样品中色素和固醇类杂质。无水硫酸镁则主要用于去除萃取液中的水分。

采用空白基质加标100 μg/kg 回收法比较了吸附剂及其用量对农药及代谢物提取效率的影响：无水硫酸镁(300 mg)，PSA(25、50、100 mg)，GCB(2.5、5.0、10.0 mg)。结果表明：无水硫酸镁为吸附剂时，灭蝇胺回收率低于50%，多菌灵和戊唑醇回收率为71%~76%；GCB 为吸附剂时，多菌灵、氯虫苯甲酰胺、吡唑醚菌酯、嘧霉胺和灭蝇胺回收率为20%~65%，且随着GCB 用量增加，回收率呈下降趋势；PSA 为吸附剂时，各组分回收率比较理想。后经各组分的复配试验，综合比较样品净化效果及对色谱柱和仪器的影响，选择无水硫酸镁(300 mg)、GCB(5.0 mg)、PSA(50 mg)为净化剂，在加标水平为100 μg/kg 时，各化合物的回收率为85%~103%。

2.5 标准曲线、线性范围及检出限

用姜空白基质提取液将各农药及代谢物混合标准溶液稀释成1、2、5、10、20、50、100、200 μg/kg系列浓度基质混合标准工作溶液分别进行测定。以峰面积为纵坐标，基质混合标准工作溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量。各农药及代谢物的线性回归方程、相关系数、线性范围及检出限(信噪比S/N≥3)见表3。结果表明，各农药及代谢物的线性回归方程的线性范围良好，相关系数均大于0.995。以3 倍基线噪音所对应的基质标准品浓度为方法的检出限，10 倍基线噪音所对应的基质标准品浓度为方法的定量限，得到38 种农药及6 种代谢物的定量限为3.0~5.0 μg/kg，检出限为1.0~2.0 μg/kg(表3)。

表3 加标回收率及精密度测定结果(n=6)

2.6 精密度和准确度

选择一份上述农药残留均未检出的空白样品，分别添加10、20、100 μg/kg 的混合标准溶液进行加标回收试验，每个添加水平平行测定6 次，按照优化条件进行样品前处理后分析测定，加标回收率为71.9%~102.2%，相对标准偏差(RSD)为1.1%~8.9%，结果见表3。

2.7 方法应用

基于所建立方法，对市售50 份生姜样品农药残留进行了检测，按检出率由低到高排列，依次为噻虫胺、噻虫嗪、咪鲜胺、氯虫苯甲酰胺、灭蝇胺、氯吡脲、吡唑醚菌酯，检出率为2.0%~11.2%，残留含量为0.011~0.345 mg/kg，其中3 份姜中2 种农药超出了最高残留限量标准。

3 结论

采用QuEChERS 前处理法，结合超高效液相色谱-串联质谱测定，建立了生姜中多种农药及代谢物残留的同时检测方法。方法学考察结果显示，各农药LOD 为1~3 μg/kg，标准曲线r≥0.995，平均回收率为71.9%~102.2%，RSD 为1.1%~8.9%；能够满足生姜中多种农药及代谢物残留的快速检测需要。所建立检测方法操作简便、高效灵敏、准确，可为生姜中相关农药及代谢物残留监测提供技术支撑。