狼疮性肾炎患者血清和尿液集落刺激因子-1的表达水平变化及意义

徐静,周宝均,徐庆(无锡市中医医院 .输血科,.检验科,江苏无锡 214001)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种多发于青年女性的自身免疫性疾病,约70%～80%的SLE患者可出现狼疮性肾炎(lupus nephritis, LN),其病变的严重程度与患者的预后密切相关[1-2]。目前,LN的实验室诊断主要有以下几种方法:尿蛋白、尿沉渣、肾小球滤过率检测或者肾脏活检[3-5]。然而,上述指标异常往往发生在肾脏损害之后。因此,探索LN肾脏结构破坏和肾功能丧失前的生物学标志物显得非常重要,这对于患者早期治疗和延缓疾病进程意义重大。

集落刺激因子-1(colony-stimulating factor-1, CSF-1)是一种在巨噬细胞分化、存活、增殖和活化过程中起重要作用的主要调节因子。研究表明,肾小管上皮细胞中高表达CSF-1,而且随着LN进展,肾间质细胞中CSF-1的表达水平明显增多,并且可以诱发或加重LN[5]。因此,CSF-1可能作为LN的检测生物学标志物。本研究旨在动态监测LN患者血液和尿液中CSF-1水平,计算尿液中CSF-1与肝酐比值(CSF-1/Cr),并分析其与临床常规实验室检查指标的相关性。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集2021年1月至2022年8月于无锡市中医医院风湿科就诊的LN患者30例,女26例,男4例,年龄(34.2±2.7)岁。患者诊断均符合美国风湿病学会(ACR)SLE分类标准[6],均行肾脏穿刺病理检查,常规行光镜、免疫荧光及电镜染色,且经病理活检证实为LN。入选者为初治患者,未接受任何治疗。排除标准:(1)感染,如肺炎(细菌、病毒或者真菌),肺结核,乙型肝炎和丙型肝炎,皮肤感染,中枢神经系统感染;(2)严重器官损害,如心脏衰竭,肝衰竭,肾衰竭,呼吸系统衰竭。应用2000版SLEDAI评分标准评价疾病活动情况[7]。病理切片按2003年国际肾脏病学会/肾脏病理学会(ISN/RPS 2003)分型方案进行分型[8]。从初次诊治日期起,随访第1和第3个月。收集同期于体检中心体检,且性别和年龄匹配的体检健康者20例作为健康人对照组,女18例,男2例,年龄(30.3±5.6)岁。

1.2主要仪器及试剂 人CSF-1 ELISA检测试剂盒(美国R&D system公司),补体C3检测试剂盒(宁波瑞源生物科技公司),尿蛋白检测试剂(北京利德曼生化股份公司),抗dsDNA抗体检测试剂盒(美国Sigma公司),肌酐检测试剂盒(爱尔兰贝克曼库尔特公司)。Thermo Scientific Multiskan 全波长酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司),Beckman Coulter AU5800生化分析仪(爱尔兰贝克曼库尔特公司)。

1.3方法

1.3.1临床资料及样本收集 收集所有患者入院后的临床资料,包括:年龄、性别、病程、病史等。另收集患者住院期间的临床常规实验室检查指标数据。分别采集LN患者住院第1天和体检健康者体检时晨起空腹(禁食8～12 h)静脉血各5 mL,2 500×g离心15 min,血清样本置于-80 ℃保存,检测前于室温解冻。所有研究对象均留取晨起清洁中段尿5 mL,400×g离心15 min,收集上清液,尿液样本置于-80 ℃保存,检测前于室温解冻。

1.3.2抗dsDNA检测 采用ELISA法,按照抗dsDNA抗体检测试剂盒说明书操作检测。使用Thermo Scientific Multiskan全波长酶标仪在450 nm处读取吸光度A值。比较并计算各组之间的A450 nm值。

1.3.3补体C3检测 取3 μL血清,按照补体C3检测试剂盒检测试剂盒说明书操作,用Thermo Scientific Multiskan全波长酶标仪读取吸光度(A340 nm)值。通过多点定标曲线折线计算相应补体C3含量(参考区间:0.7～1.4 g/L)。

1.3.424 h尿蛋白检测 取5 μL尿液,按照尿蛋白检测试剂说明书检测,以主波长600 nm、副波长700 nm读取吸光度A值。计算尿蛋白浓度(参考区间:0～140 mg/L)。计算公式:尿蛋白浓度=ΔA样本×校准液浓度/ΔA校准(ΔA=ΔA待测-ΔA空白)。

1.3.5Cr测定 采用肌氨酸氧化酶法,取5 μL血清,按照肌酐检测试剂盒说明书操作进行,在Beckman Coulter AU5800生化分析仪上以主波长600 nm、副波长700 nm读取吸光度A值(参考区间:49～104 μmol/L)。

1.3.6CSF-1检测 采用ELISA法,在包被有抗CSF-1抗体的酶标孔中分别加入100 μL稀释过的标准品和血清或尿液,室温温育2 h;洗板3次。在标准品孔与样品孔中分别加入200 μL辣根过氧化物酶标记的抗人CSF-1抗体,再次室温温育30 min后每孔加入50 μL终止液。分别于450 nm和570 nm处读取吸光度A值,绘制标准曲线,计算样本CSF-1浓度(血清参考区间:180～474 pg/mL;尿液参考区间:263～4 466 pg/mL)。

2 结果

2.1LN患者血清CSF-1和尿液CSF/Cr水平 ELISA法检测结果发现,LN患者血清CSF-1显著高于体检健康者 (98.41±4.12 pg/mL vs 10.10±0.31 pg/mL,t=17.41,P<0.001)。LN患者尿液CSF-1/Cr显著高于体检健康者 (2.75±0.13 pg/mg.Cr vs 0.89±0.04 pg/mg.Cr,t=11.20,P<0.001)。

2.2CSF-1与LN患者病理分型的相关性 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型患者血清CSF-1水平及尿液CSF-1/Cr差异均有统计学意义(F分别为40.93和23.69,P<0.001)。进一步进行组间两两比较结果表明,与Ⅱ型LN患者(74.47±2.66) pg/mL相比,Ⅲ型及Ⅳ型LN患者血清CSF-1水平明显升高 (96.23±2.84 pg/mL,125.2±5.99 pg/mL,q分别为6.194,12.19,P<0.01),并且Ⅳ型LN患者血清CSF-1水平较Ⅲ型显著升高(q=7.707,P<0.01)。此外,与Ⅱ型LN患者(2.07±0.12 pg/mg.Cr)相比,Ⅲ型及Ⅳ型LN患者尿液CSF-1/Cr明显升高(2.77±0.06 pg/mg.Cr,3.55±0.26 pg/mg.Cr,q分别为5.185,9.728,P<0.01),并且Ⅳ型LN患者尿液CSF-1/Cr也较Ⅲ型LN患者显著升高(q=5.416,P<0.01)。

2.3CSF-1与患者治疗效果的关系 共计5例LN患者完成随访,分别检测了随访第1和第3个月时的血清CSF-1和尿液CSF-1/Cr,以及实验室指标(包括补体C3、抗dsDNA和24 h尿蛋白)。结果表明,随着患者病情缓解,LN患者血清CSF-1及尿液中CSF-1/Cr明显下降,抗dsDNA和24 h尿蛋白亦显著降低,而补体C3水平明显增加,见表1。

表1 LN患者CSF-1、CSF-1/Cr及各实验室指标检测结果

3 讨论

LN是SLE患者最常见和最严重的并发症。LN若得不到有效控制,会进展至终末期肾衰。LN的特征包括持续存在的蛋白尿、镜下血尿和进行性肾功能下降等特征[9]。迄今为止,肾脏活检仍然是LN诊断的金标准[10-11],但LN的进展和疗效判断无法采用肾脏活检等创伤性技术。因此,探索非创伤性的LN诊断、进展和疗效评估的生物学标志物是该领域的研究热点和难点。本研究通过比较体检健康者与LN患者血清CSF-1水平、尿液CSF-1/Cr和常规实验室检查指标(抗dsDNA、24 h尿蛋白及补体C3)等,并进行动态随访,以期为LN患者提供新的生物学标志物。

CSF-1作为能刺激单核细胞和巨核细胞分化的一种生长因子,可激发和增强巨噬细胞对肿瘤细胞和微生物的杀伤作用,调节巨噬细胞释放细胞因子和其他炎症调节因子,并刺激胞饮作用。研究发现,CSF-1在妊娠期间增加,并支持蜕膜和胎盘的植入和生长[12-13]。另有学者发现,肾小管上皮细胞高表达CSF-1,而且随着LN进展,肾间质CSF-1的表达量增高[5]。以上结果提示CSF-1参与LN的进展过程,可能成为LN的生物学标志物。Menke等[14]证实肾小球滤过率等对尿液CSF-1的表达水平存在较大的影响。本研究亦发现LN患者血清和尿液CSF-1水平均显著高于体检健康者,且LN患者尿液CSF-1/Cr亦明显增加。

目前临床根据LN患者的肾脏病理严重程度,将LN患者划分为Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型,笔者进一步检测并比较了各亚型患者血清CSF-1水平及尿液CSF-1/Cr。结果表明随着患者的病情加重,Ⅲ型或Ⅳ型LN患者血清CSF-1水平及尿CSF-1/Cr显著高于Ⅱ型LN患者(P<0.05),且Ⅳ型亦高于Ⅲ型LN患者(P<0.05),这进一步证实了血清CSF-1水平及尿液CSF-1/Cr可以反映LN患者的肾脏病变严重程度。

笔者还检测了5例缓解期随访LN患者CSF-1水平和尿液CSF-1/Cr以及常规实验室指标,结果发现随着病情缓解, LN患者抗dsDNA和24 h尿蛋白显著降低,补体C3明显增加,患者的CSF-1及尿液CSF-1/Cr也显著降低,提示上述指标可用于判断LN的活动性。