食管癌患者血清中circAGFG1表达与预后的相关性

周梓婷,颜建业,郑智弦,翟励敏(1.梧州市红十字会医院a.医学检验科, b.肿瘤科,广西梧州 54300;.桂林市人民医院检验科,广西桂林 541000)

食管癌属于消化道恶性肿瘤,由于其发病早期症状不明显,许多患者确诊时病情已发展至中后期,严重影响患者生活质量甚至生存时间,早期诊断和及时治疗对食管癌患者预后良好及提高生活质量水平具有重要意义[1]。肿瘤标志物检测是临床常用的肿瘤诊断方法,其用于监测肿瘤发生具有简便快速,经济无创的优点[2]。肿瘤标志物中的甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖类抗原19-9(CA19-9)、鳞状细胞癌抗原(SCC)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)是临床上常见的消化道肿瘤检测指标[3]。近年来研究发现,circAGFG1在多种恶性肿瘤中的表达上调,其水平与宫颈癌、结直肠癌等肿瘤的恶性程度呈正相关,并可促进肿瘤的发生与发展[4-5],但其在食管癌中的研究报道罕见。因此,本研究旨在检测并分析食管癌患者血清circAGFG1的表达情况,评估其对食管癌患者预后的临床应用价值。

1 研究对象与方法

1.1研究对象 选取2017年1月至2019年2月在梧州市红十字会医院肿瘤科就诊的100例食管癌患者作为研究对象,男52例,女48例,年龄(61.8±6.6)岁,以同期体检健康者40例作为健康人对照组,男26例,女14例,年龄(59.7±6.1)岁,两组在年龄和性别间的差异均无统计学意义(P>0.05)。纳入标准:(1)符合临床食管癌诊断标准[6],并经病理组织学确诊为食管癌;(2)初诊未接受过化疗或手术治疗。排除标准:(1)患有肝、肾等其他器官疾病;(2)患有其他恶性肿瘤、血液相关疾病等;(3)伴有慢性感染或急性感染者;(4)临床病例资料不全者。以电话及门诊复查的方式对所有食管癌患者随访3年,患者出现复发或因食管癌死亡则随访结束,患者随访率为100%。生存时间为术后日期至患者死亡时间或最终随访截止时间。本研究遵循《世界医学协会赫尔辛基宣言》,并通过梧州市红十字会医院医学伦理委员会审核批准(批准文号:20161208),所有研究对象均签署知情同意书。

1.2主要试剂与仪器 RNA提取试剂盒(北京天根生化科技公司),实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒(上海联硕生物科技公司),AFP、CEA、CA19-9、SCC及CYFRA21-1检测试剂盒,Cobas e601罗氏全自动电化学发光免疫分析系统(上海罗氏诊断产品公司),Life实时荧光定量PCR仪(珀金-埃尔默公司)。

1.3方法

1.3.1样本采集 分别采用不含抗凝剂的试管采集食管癌患者住院第1天(治疗前)和体检健康者体检时晨起空腹(禁食8～12 h)静脉血4～6 mL,3 500 r/min离心15 min后取上层血清,置于-80 ℃保存。

1.3.2血清circAGFG1检测 采用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR检测各组血清circAGFG1的相对表达量。按照RNA提取试剂盒说明书提取血清标本中的总RNA样本,通过分光光度计检测其浓度和纯度,取吸光度(A260 nm/A280 nm)值为2.0,浓度>25 ng/μL的样本,采用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA,cDNA样本置于-80 ℃保存。各引物由上海联硕生物科技公司合成,并采用Primer express 3.0软件设计。circAGFG1 GenBank序列号为NM_004504.5,其上游引物序列:5′-CCAGTTGTAGGTCGTTCTCAAG-3′,下游引物序列:5′-GGATTTAATCCTCGCCTGCATG-3′,退火温度为59 ℃,产物片段大小204 bp;GAPDHGenBank序列号为NM_001357943,其上游引物序列:5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,下游引物序列:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′,退火温度为57 ℃,产物片段大小172 bp。按照实时荧光定量PCR试剂盒及Life实时荧光定量PCR仪说明书进行PCR扩增。PCR总反应体系为20 μL,包括:PCR Master Mix 10 μL,10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL,cDNA模板2 μL,ddH2O补足体积。PCR反应条件:95 ℃预变性3 min,95 ℃变性5 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40个循环。采用Life实时荧光定量PCR仪自带软件于72.5 ℃时收集荧光信号并进行熔解曲线分析,计算循环阈值(Ct)。以GAPDH作为内参基因,采用2-ΔΔCt法计算circAGFG1的相对表达水平,ΔΔCt=(ΔCt实验组-ΔCt健康人对照组),ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因,每个Ct值为样本重复检测3次结果取均值。

1.3.3各肿瘤标志物检测 采用电化学发光法,按照全自动化学发光免疫分析仪及AFP、CEA、CA19-9、SCC及CYFRA21-1检测试剂盒说明书操作检测食管癌患者和健康人对照组血清AFP、CEA、CA19-9、SCC、CYFRA21-1的表达水平。AFP参考区间:0～25 ng/mL;CEA参考区间:0～4.7 ng/mL;CA19-9参考区间:0～40 U/mL;SCC参考区间:0～1.5 ng/mL;CYFRA21-1参考区间:0～3.3 ng/mL。

2 结果

2.1各组血清circAGFG1的表达水平 实时荧光定量PCR检测血清circAGFG1结果显示,食管癌患者血清circAGFG1的表达水平(1.37±0.36)显著高于健康人对照组(0.98±0.24),差异具有统计学意义(t=6.307,P<0.001)。

2.2血清circAGFG1水平与食管癌患者临床病理参数的关系 食管癌患者血清circAGFG1水平与TNM分期和淋巴结转移有关(P<0.05),而与年龄、肿瘤直径、吸烟等指标无关。见表1。

表1 血清circAGFG1水平与食管癌患者临床病理参数的关系

2.3各组肿瘤标志物指标的检测结果 食管癌患者血清AFP、CEA、CA19-9、SCC、CYFRA21-1水平均显著高于健康人对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 食管癌患者、健康人对照组各肿瘤标志物指标水平比较

2.4不同生存期食管癌患者预后及其与临床病理参数的关系 生存组患者TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移率、CEA、SCC、CYFRA21-1、circAGFG1水平均显著低于死亡组(P<0.05),而两组患者在年龄、性别、吸烟史、肿瘤直径、AFP、CA19-9水平之间的差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 不同生存期食管癌患者预后情况与临床病理参数的关系

2.5血清circAGFG1表达与食管癌患者3年生存率的关系 以食管癌患者血清circAGFG1水平的均值(1.37)为界值,将患者分为circAGFG1高表达组(32例)和circAGFG1低表达组(68例)。采用Kaplan-Meier法分析食管癌患者血清circAGFG1水平与预后的关系,结果显示食管癌患者血清circAGFG1高表达患者的3年生存率为25.00%(8/32),显著低于低表达患者的79.41%(54/68),差异具有统计学意义(χ2=7.506,P<0.05)。见图1。

图1 不同血清circAGFG1水平食管癌患者的生存曲线分析

2.6食管癌患者预后影响因素的Cox回归分析 以TNM分期(Ⅰ～Ⅱ期=1,Ⅲ～Ⅳ期=0)、淋巴结转移(无=1,有=0)、CEA(<4.61 ng/mL=1,≥4.61 ng/mL=0)、SCC(<1.64 ng/mL=1,≥1.64 ng/mL=0)、CYFRA21-1(<3.36 ng/mL=1,≥3.36 ng/mL=0)和circAGFG1(<1.37=1,≥1.37=0)为自变量,随访时间为时间变量,预后(生存=1,死亡=0)为因变量。多因素Cox回归分析显示,TNM分期、CEA、CYFRA21-1和circAGFG1为食管癌患者预后的影响因素(P<0.05)。见表4。

表4 多因素COX回归分析食管癌患者预后的影响因素

3 讨论

蒋之胜等[7]研究发现,食管癌患者术前血清CYFRA21-1和CEA水平是预后生存的独立影响因素,术前联合检测肿瘤标志物对食管癌患者生存预测具有较高的敏感性。本研究结果显示,食管癌患者血清AFP、CEA、CA19-9、SCC、CYFRA21-1水平均显著高于健康人对照组,且生存组患者TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移率、CEA、SCC、CYFRA21-1水平显著低于死亡组。多因素Cox回归分析显示,TNM分期、CEA、CYFRA21-1为食管癌患者预后的影响因素,与蒋之胜等[7]的研究结果相一致,提示肿瘤标志物水平与食管癌病情发展密切相关,对患者预后评估具有一定的价值。

circAGFG1是近年来新发现并被研究的环状RNA,在多种肿瘤组织中的表达异常,有学者发现circAGFG1在食管癌组织中明显上调,circAGFG1可通过调控miR-4306/MAPRE2轴,促进食管癌的进展,并可作为ESCC治疗和诊断的潜在生物标志物[8]。本研究结果显示,食管癌患者血清circAGFG1水平显著高于健康人对照组,且其水平与食管癌患者TNM分期和淋巴结转移有关,表明circAGFG1参与了食管癌的进展,或可用于监测临床进展情况。另外,本研究结果还发现,生存组circAGFG1水平显著低于死亡组(P<0.05),且circAGFG1高表达患者的3年生存率(25.00%)显著低于低表达患者(79.41%),表明circAGFG1是食管癌患者预后的影响因素,circAGFG1水平与食管癌病情进展密切相关,对患者预后评估具有一定的临床应用价值。但是本研究未能进一步探究circAGFG1水平与AFP、CEA、CA19-9、SCC、CYFRA21-1等肿瘤标志物之间的区别,且未能采用ROC曲线对其诊断食管癌的临床应用价值进行评估,后续笔者将扩大量样本量,深入探究circAGFG1检测对食管癌的临床意义,并进一步探讨其与各种肿瘤标志物的差异,以期为circAGFG1作为临床评估食管癌预后标志物提供有效依据。