施加微生物菌剂对马铃薯根际土壤细菌多样性的影响

杨 楠,谭雪莲,郭天文,3,张平良,刘晓伟

(1.甘肃农业大学 资源与环境学院,兰州 730070; 2.甘肃省农业科学院 旱地农业研究所,兰州 730070; 3.甘肃省农业科学院,兰州 730070)

甘肃省是中国马铃薯的主产区,面积和产量均居全国第三位[1]。近年来,规模化和集约化的种植模式以及化肥的不合理使用,导致马铃薯产量和品质下降、土壤微生物多样性降低、土壤生态系统失衡等问题日益突出[2],制约甘肃省马铃薯产业健康发展。因此,研究新型环保肥料对土壤生态环境具有重要的意义。微生物菌剂作为一种新型环保肥料,含有大量有效活菌,可以分解土壤有机质[3],促进土壤中难溶性养分的溶解和释放[4-5];此外,这些有效菌在生命活动过程中,能够分泌植物激素和抗生素等活性物质,刺激作物生长[6];微生物菌剂还含有大量营养成分,其特定的肥料效应能够提供作物生长所需的营养元素[7]。微生物菌剂具有改善土壤结构[8-9]、提高土壤微生物丰富度[10]、减轻病虫害[11]等作用,可实现农业的持续发展。前人研究表明,哈茨木霉菌在提高枸杞幼苗成活率的同时,提高了果实内含物多糖、甜菜碱、总黄酮含量和胡萝卜素[12];施用菌剂可有效降低连作棉田棉花黄萎病的发病率,并增产9.64%～26.21%,缓解连作障碍的同时,显著降低棉花根系丙二醛的含量,提高根系活力,减轻作物的自毒作用,也可显著提高连作土壤碱解氮、有效磷和速效钾含量,较不施菌剂处理分别增加15.4%、36.8%、19.8%[13];复合微生物菌剂与氨基酸水溶肥组合施用显著提高了香蕉土壤有益菌鞘氨醇单胞菌属的物种丰度,且显著降低了土壤致病真菌炭疽菌属的物种丰度,降低香蕉发病率[14]。目前,微生物菌剂对马铃薯土壤微生物多样性的研究鲜有报道。本研究采用高通量测序对马铃薯土壤微生物多样性进行研究,从微生物生态学的角度探讨施用不同剂量微生物菌剂马铃薯根际土壤细菌群落组成和多样性,为土壤可持续发展作理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2020年在甘肃省定西市团结镇高泉山上进行。该地区位于北纬35°24′21″,东经 104°34′94″,海拔2 155 m,年平均气温较低,年平均降水量500～550 mm,属干旱、半干旱地区。试验地前茬作物是柴胡,土壤肥力良好,0～20 cm土层的有机质、全氮、全磷、全钾、速效氮、速效钾分别为7.5 g·kg-1、0.73 g·kg-1、0.67 g·kg-1、19.9 g·kg-1、15.12 mg·kg-1、 174.81 mg·kg-1,pH为8.21。

1.2 试验设计

供试马铃薯品种为‘陇薯10号’,试验所用菌剂为黑沃土酸性微生物颗粒菌剂(有效活菌数≥5 亿/g),功能菌为枯草、地衣、解淀粉芽孢杆菌以及哈茨木霉菌等多种复合菌,总养分≥15%( N:10%,P2O5:2%,K2O:3%),定殖率为37.8%,由黑沃土生物科技有限公司提供。大田试验共设计6个处理,分别为:不施肥对照处理CK;单施化肥对照处理F(N:180 kg·hm-2,P2O5:90 kg·hm-2,K2O:90 kg·hm-2);处理T1(化肥+颗粒菌剂 75 kg·hm-2);处理T2(化肥+颗粒菌剂 150 kg·hm-2);处理T3(化肥+颗粒菌剂225 kg·hm-2);处理T4(化肥+颗粒菌剂300 kg·hm-2),其中施菌剂处理所施用的化肥量均与单施化肥相同,化肥全部一次性在播前基施,黑沃土酸性微生物颗粒菌剂采用穴施。试验共18个小区,长8 m,宽6 m,面积48 m2,试验地四周均设有4行保护行。马铃薯采用全膜覆盖垄播栽培,垄高30 cm、行距60 cm、株距30 cm,播种密度:52 500穴·hm-2。试验于2020年4月20日播种,于10月20日成熟收获。

1.3 田间管理及样品采集

播前撒施毒死蜱杀虫药75 kg·hm-2,预防虫害。苗高8～10 cm时结合锄草适时中耕培土提高地温,疏松土壤。样品于2020年8月采集各试验小区耕层(0～20 cm)土壤新鲜样品,将植株和周围的土体取出,轻轻抖落掉根系外围土,取其表层土壤,将取到的土样混合均匀,土样装到无菌袋密封,放入冰盒带回实验室,并在-80 ℃的冰箱储存,土样用于后续土壤微生物DNA提取及微生物多样性分析。

1.4 根际土壤总DNA提取及PCR扩增

土壤样品利用CTAB方法对基因组DNA进行提取,提取后的DNA使用 Qbiut(厂家 invitrogen,试剂 Qubit TM dsDNA HS Assay Kit)进行浓度检测,使用10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的完整性。PCR扩增采用细菌通用引物338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCA)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)进行扩增,PCR反应用10 μL体系:KOD FX Neo Buffer 5 μL,2 mmol·L-1dNTPs 2 μL,正向引物(10 μmol·L-1)0.3 μL,反向引物(10 μmol·L-1)0.3 μL,KOD FX Neo 0.2 μL,Template DNA 5～50 ng,补ddH2O至10 μL。扩增条件为95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,共25个循环,72 ℃延伸7 min,4 ℃保存备用。基于Illumina Novaseq测序平台构建小片段文库进行双末端测序,委托北京百迈客生物科技有限公司完成。

1.5 数据分析与处理

高通量测序得到的原始数据通过拼接过滤最后保留高质量序列用于分析,符合的序列进行OTU聚类分析,基于聚类结果进行多样性分析;分析不同分类水平下土壤细菌在群落结构上的相似性。采用Microsoft Excel 2016对试验数据进行处理与作图,采用DPS 9.01进行统计分析,LSD法进行差异显著性检验。使用QIIME2(Version 2020.6)计算Chao1、ACE、Shannon指数,采用基于Binary-Jaccard距离矩阵对细菌群落进行β多样性分析。

2 结果与分析

2.1 测序数据质量评估及OTU聚类分析

由表1可知,6个样品共获得原始序列 946 008条,通过质控后获得高质量序列849 727条,有效序列数共797 583条,平均序列长度为 417.67 bp。其中,土壤样本CK、F、T1、T2、T3、T4分别读取了142 137、143 102、145 191、 144 629、144 456、130 212条优化序列,T4与其他处理差异显著。

表1 样本测序数据统计结果Table 1 Statistical results of sample sequencing data

依据0.97的序列相似性在6个土壤样本中共检测出9 939个OTU,每一个OTU被视为一个微生物物种。所有的OTU数量可分为30门、85纲、180目、266科、426属、463种。各土壤样本CK、F、T1、T2、T3、T4所含的OTU数分别为1 666、1 657、1 653、1 676、1 656、1 631,其中共有的OTU数为1 558。各处理所含OTU数排序为T2>CK>F>T3>T1>T4,其中F与T2差异显著,T2较F增加1.15%;随着菌剂用量的增加,OTU数量呈现出先增加后降低的趋势,在菌剂用量增加到150 kg·hm-2(T2)时达到最大值,T2与T4差异显著,较T4增加2.76%。由此表明施用化肥+颗粒菌剂150 kg·hm-2可显著提高OTU数量。

图1是相似度在0.97条件下各土壤样品的稀释曲线,细菌丰富度稀释曲线呈现出的趋势为先升高后趋于平缓,逐渐达到饱和状态,表明所测的样品序列很充分,环境中的物种数目不会因为所测序列的增加而一直增加,可以真实的反映样品中的细菌群落。

图1 相似度为0.97条件下各土壤样品的稀释曲线Fig.1 Dilution curve of each soil sample with similarity of 0.97

2.2 根际土壤细菌的多样性分析

2.2.1 土壤α多样性分析 在供试土壤样品Alpha多样性指数中,Chao1指数和ACE指数越大表明土壤样品中细菌的含量越高,土壤菌种的丰富度越高。Shannon指数代表了菌群的多样性,指数大小与菌群多样性高低成正比。由表2可知,Chao1指数在各处理中的大小依次为T2>CK>T1>T4>T3>F,与F相比,T2、T3分别增加1.33%、0.11%,两者间差异显著;在不同菌剂用量之间,T1与T2差异显著,T2较T1增加 0.65%。ACE指数排序为T2>CK>T1>F>T3>T4,F与T2有极显著差异,T2较F增加 1.14%。Shannon指数大小依次表现为F>T2>CK>T4>T1>T3,在不同菌剂用量之间,T2与T3差异显著,T2较T3增加2.15%,施用菌剂处理与对照无显著差异。结果表明,较单施化肥,微生物菌剂可以显著增加土壤细菌的丰富度,尤以菌剂用量为150 kg·hm-2时作用最明显;与不同菌剂用量相比,菌剂用量为150 kg·hm-2可以提高土壤细菌的多样性。

表2 不同处理马铃薯根际土壤细菌群落多样性Table 2 Diversity of bacterial community in potato rhizosphere soil under different treatments

2.2.2 土壤β多样性分析 图2为OTU水平下采用样品间jaccard距离矩阵绘制的聚类热图,样品距离热图的颜色可以反映样品间土壤细菌群落结构与多样性的差异,颜色越蓝表示样品间距离越近,细菌群落相似度越高,越红则距离越远。T4与CK、F、T1的土壤细菌群落之间具有差异,其中T4和F、T1的细菌群落之间的差异显著。说明施用菌剂的用量越高对土壤细菌群落的影响越大。

图2 OTU水平下土壤细菌距离热图Fig.2 Heatmap of soil bacteria distance at OTU level

2.3 根际土壤细菌群落结构多样性分析

2.3.1 门水平根际土壤细菌群落结构变化 图3为供试土壤细菌门水平上的分类,其中相对丰度较高的分别是变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)。土壤细菌各处理在组成上没有区别,但在菌群结构和相对丰度上有一定差异。变形菌门是各供试土壤的优势菌门(占比为31.40%～34.78%),相对丰度最高,各处理间差异不显著。放线菌门在土壤中分布较广,是本研究的第二大优势菌门,与F相比,T4放线菌门相对丰度增加4.59%,CK、T1、T2、T3分别降低29.19%、17.08%、8.26%、0.77%,其中F与其余各处理均达到显著水平,且与CK、T1、T2达到极显著水平,T4放线菌门相对丰度最高,较CK增加35.10%。酸杆菌门菌剂用量为300 kg·hm-2(T4)时土壤菌群丰度最高,在不施肥土壤中丰度最低,与CK相比,T2、T3、T4分别降低27.38%、22.17%、33.24%,两者之间均有显著差异,且CK与T4达到极显著水平;与F相比,T4酸杆菌门相对丰度降低29.33%,两者差异显著;随着菌剂用量增加,酸杆菌门在土壤中的相对丰度呈现先降低再增加后降低的趋势,菌剂用量增加到300 kg·hm-2(T4)时达到最低值,其中T1与T4差异显著,T4较T1降低 26.81%。与CK、F相比,T4芽单胞菌门相对丰度分别降低25.16%、 21.01%,两者之间均有显著差异,且CK与T4达到极显著水平;随着菌剂用量增加,芽单胞菌门在土壤中相对丰度变化趋势与酸杆菌门相同,T4较T1、T3分别降低21.01%、 17.73%,两者之间有显著差异。由此可见,施用微生物菌剂可显著引起马铃薯根际土壤细菌门水平群落组成的变化,较不施肥和单施化肥,施用微生物菌剂会显著降低酸杆菌门、芽单胞菌门的相对丰度,且以菌剂用量300 kg·hm-2时最为显著。较单施化肥,菌剂用量为300 kg·hm-2时可以显著提高放线菌门的相对丰度,其余处理则会降低放线菌门的相对丰度。

图3 供试土壤细菌门水平分类Fig.3 Classification of bacterial phylum level in tested soil

2.3.2 纲水平根际土壤细菌群落结构变化 由图4可知,供试土壤细菌在纲水平上主要有α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes)、Subgroup_6、放线菌纲(Actinobacteria)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、酸微菌纲(Acidimicrobiia)、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)、母链菌纲(Blastocatellia_Subgroup_4)、绿弯菌纲(Chloroflexia)。平均丰度小于1.50%的部分(others)未在图中显示。通过细菌群落丰度比例可知,α-变形菌纲(17.54%～19.56%)和γ-变形菌纲 (10.24%～13.62%)在土壤细菌结构中所占比例最大,α-变形菌纲是各处理的优势菌纲,各处理间差异不显著。γ-变形菌纲是第二大优势菌纲,其相对丰度大小依次为:T4>T2>T3>T1>CK>F,与CK相比,T4 γ-变形菌纲相对丰度增加32.04%,两者有显著差异。与CK相比,T4芽单胞菌纲相对丰度降低了26.91%,两者达到极显著水平;随着菌剂用量增加,其相对丰度呈现出先降低后增加再降低的趋势,T2、T3、T4较T1分别降低 14.38%、11.94%、32.45%。与CK、F相比,T3放线菌纲相对丰度分别增加129.11%、 59.48%,T4分别增加169.68%、87.72%,T3、T4和CK、F差异显著,其中CK和T3、T4达到了极显著水平;在不同菌剂用量中T3、T4较T1分别增加 93.39%、127.63%,且两者之间差异显著。与F相比,T2、T3、T4拟杆菌纲相对丰度分别增加74.19%、73.52%、124.49%,且两者间达到极显著水平;与CK相比,T4拟杆菌纲相对丰度增加了59.73%,两者间有显著差异;在不同菌剂用量之间,T1与T2、T3、T4有显著差异,T2、T3、T4较T1分别增加46.80%、46.24%、 89.20%。与F相比,T3、T4酸微菌纲相对丰度分别降低 21.38%、24.04%,两者间均有显著差异。与CK相比,T2、T3、T4母链菌纲相对丰度分别降低 32.25%、29.20%、38.10%,两者间均有显著差异,且CK与T4达到极显著水平。绿弯菌属于光合细菌类群,能够利用光合作用来维持生存。与F相比,T1、T2绿弯菌纲相对丰度分别降低了39.38%、40.45%,两者间有显著差异。由此可见,施用微生物菌剂可显著引起马铃薯根际土壤细菌纲水平群落组成的变化,较不施肥,微生物菌剂可以显著提高γ-变形菌纲相对丰度,可以显著降低芽单胞菌纲、母链菌纲相对丰度,且都以菌剂用量为300 kg·hm-2时最显著。较单施化肥,微生物菌剂可以显著降低酸微菌纲、绿弯菌纲相对丰度。较对照,菌剂用量为300 kg·hm-2可以显著提高放线菌纲和拟杆菌纲相对丰度。

图4 供试土壤细菌纲水平分类Fig.4 Classification of bacterial class level in tested soil

3 讨 论

土壤中大量的细菌会抑制病原菌的生长繁殖,土壤细菌的丰富度与土壤健康息息相关[15]。本研究基于高通量测序平台Illumina Novaseq对不同用量微生物菌剂的马铃薯根际土壤细菌的多样性进行了分析,结果表明,马铃薯施用微生物菌剂后土壤细菌多样性发生显著变化,单施化肥与菌剂用量为150 kg·hm-2两者差异显著,说明施用菌剂可以显著增加土壤细菌的Chao1指数和ACE指数。前人研究结果也证明,复合木霉菌菌剂处理后的小麦根际土壤细菌Shannon指数及Chao1指数显著增加[16];枯草芽胞杆菌菌肥会在一定程度上提高土壤细菌种群多样性,使土壤细菌群落结构更加丰富[17];黄腐酸与微生物菌剂协同处理后可显著提高烟草根际土壤细菌群落Shannon指数和辛普森指数,有效改善了根际土壤细菌的生态环境[18]。

在门、纲水平上,马铃薯根际土壤的优势菌门有变形菌门、放线菌门、酸杆菌门,本研究中变形菌门是存在于土壤中最为广泛的优势菌门,此结果与前人研究结果一致[19-24]。主要原因可能是微生物菌剂的施用影响了原有土壤微生物菌群结构,并形成了一种特定的微生态环境。本研究表明,在单施化肥的基础上,增施300 kg·hm-2的微生物菌剂可显著增加有益菌群放线菌门相对丰度,这与前人研究结果一致[25]。放线菌具有解磷固氮的作用,其代谢产物中产生的一些物质不仅对病原菌有拮抗作用[26],还可以降解一些有毒有害物质[27-28],说明微生物菌剂会明显减轻病原菌和有害物质对土壤的侵害,使土壤生态系统向着健康的方向发展。酸杆菌门是本研究中的第三大优势菌门,酸杆菌门适宜在较贫瘠的土壤上生存[29],其相对丰度与土壤肥力成反比,可以作为土壤养分状况的指示菌[30]。本研究中不施肥处理中酸杆菌门的相对丰度最低,单施化肥次之,而菌剂用量为300 kg·hm-2相对丰度最高,说明微生物菌剂可以有效活化土壤养分、提高土壤肥力。纲水平上,本研究发现,较不施肥,菌剂用量为300 kg·hm-2会显著提高γ-变形菌纲的相对丰度,这与李金花等[31]、谭雪莲[32]的研究结果相反,原因可能是菌剂用量为300 kg·hm-2的土壤处于高营养状态,γ-变形菌纲在土壤养分含量较高的环境中含量丰富,且含有一些优势菌,例如:氨氧化细菌,说明高养分含量对γ-变形菌纲的相对丰度有促进作用。此外,研究发现较不施肥与单施化肥,施用菌剂也会显著提高拟杆菌纲、放线菌纲的相对丰度。拟杆菌具有溶磷作用,其相对丰度和速效磷含量成正比[25],拟杆菌不仅对土壤有机碳转化为无机碳的过程起到重要作用[30],而且还可以分解高分子物质达到降解的目的[33]。酸微菌纲、放线菌纲均属于放线菌门,以往研究表明,放线菌纲对增加土壤有机碳、氮磷比、碳氮比上有极显著的作用,但会降低土壤pH,而酸微菌纲与土壤pH呈显著正相关关系[34],本研究供试土壤为碱性土壤,施用菌剂使酸微菌纲显著降低,说明菌剂有中和土壤酸碱度的作用,放线菌纲在施用菌剂后显著增加,说明施用菌剂会促进土壤营养元素的流动,这与前人研究结果一致[35]。本研究中菌剂用量为300 kg·hm-2较不施肥会显著降低芽单胞菌纲的相对丰度,这与前人研究结果一致[14,36]。芽单胞菌纲中含有很多病原菌,如肠杆菌科、假单胞菌科,说明菌剂可以通过降低芽单胞菌纲的相对丰度,从而降低马铃薯的发病几率。

4 结 论

较单施化肥,菌剂用量为150 kg·hm-2时会显著提高土壤细菌OTU数量和丰富度。施用微生物菌剂对土壤细菌结构有很大的影响,与对照相比,菌剂用量为300 kg·hm-2时可以显著降低酸杆菌门、芽单胞菌门相对丰度,显著提高放线菌纲、拟杆菌纲相对丰度;较单施化肥,菌剂用量为300 kg·hm-2时可以显著提高放线菌门的相对丰度,显著降低酸微菌纲相对丰度;较不施肥,菌剂用量为300 kg·hm-2时可显著提高γ-变形菌纲相对丰度,降低芽单胞菌纲相对丰度。微生物菌剂显著改善了土壤细菌菌群结构,增加了有益菌的丰度,进而改善了马铃薯土壤微环境。