玉米浆对大球盖菇培养料发酵的影响

姬快乐,高 莹,贾晓桐,孙 宁,王萌萌,吴 瑕,赵立琴,范博文,杨凤军

(黑龙江八一农垦大学 园艺园林学院,黑龙江大庆 163319)

玉米浆(Corn slurry)是工业湿法加工玉米淀粉的副产物之一[10],在玉米淀粉生产过程中,为加快淀粉的释放速度,加工前使用亚硫酸钠溶液浸泡玉米粒,浸泡液经浓缩后得到的粘稠液体即为玉米浆[11]。玉米浆中富含可溶性糖类、可溶性蛋白质、多肽(以二肽为主)、游离氨基酸、脂肪酸、维生素、肌醇、水解酶等有机化合物及其无机离子[12],是微生物发酵的良好氮源。玉米浆作为生产抗生素、有机酸和其他发酵产品培养基源料已得到广泛应用,如李晶等[13]的研究表明将玉米浆发酵液加入杏鲍菇的培养料中可显著提高杏鲍菇的产量及生物学转化效率;而使用玉米浆发酵液替代传统杏鲍菇培养料中的氮源,可使杏鲍菇的营养价值得到显著提高[14];马丽峰等[15]的研究表明,在金针菇的栽培基质中加入玉米浆可有效缩短其栽培周期,提高产量和品质。但添加玉米浆对食用菌培养料发酵过程中理化性质变化的研究未见报道。

本研究旨在探讨玉米浆对大球盖菇玉米秸杆基料发酵进程的影响,明确发酵过程中基质理化性质的变化规律,揭示添加玉米浆对高温阶段微生物群落结构及多样性影响,识别核心产热代谢微生物的差异,分析理化性质与细菌群落和生物代谢间的关系,为阐明玉米浆对玉米秸秆发酵中作用提供参考,对农业废弃物资源化利用具有重要价值。

1 材料与方法

1.1 供试材料

玉米秸秆来源于黑龙江省大庆市大同区玉米田,新鲜无霉变。玉米浆来自于黑龙江八一农垦大学食品学院,尿素为市售材料。

1.2 试验设计与样品采集

试验于2020年9月在中国黑龙江八一农垦大学实验基地进行,为期9 d。将玉米秸秆切为长度2～3 cm的秸秆段备用。试验共设两个处理,CK处理为50 kg玉米秸秆中添加0.25 kg 的尿素;CS处理为50 kg玉米秸秆中添加4.45 kg玉米浆,通过添加以上两种不同外源氮使两处理初始C/N相同。混合料以1.5 m×1.5 m×1.5 m的锥形堆进行建堆发酵。每天测量堆体内温度和环境温度,在发酵过程中高温期(3 d)翻堆1次,堆体物料基本理化性质详见表1。

表1 原材料成分含量Table 1 Content of raw materials

1.3 样品采集与指标测定

在第0、3、6、9天采集发酵堆体样品,在3个深度(距堆体表面10 cm、30 cm、60 cm处)的6个不同点进行随机取样,并均匀混合,样品风干用于理化性质测定;同样方法另取第3天(高温期)样品,经液氮冷冻后存于-80 ℃冰箱,用于后期高通量测序。

利用有记忆存储功能的美信自动温度记录仪DS192X测量堆体和环境温度;含水率通过烘箱在105 ℃下将样品烘干至恒量来测定;体积质量参照DB22/T 2420-2015方法测定[16];pH和电导率值利用pH测定仪和电导率测定仪测定[17];总碳(TOC)和全氮(TN)含量的测定分别使用外加热重铬酸钾容量法和微量凯氏法测定[18];铵态氮通过KCl浸提-靛酚蓝比色法进行测定[19];对第3天(高温期)样品送至美吉生物科技有限公司进行建库测序。通过对样本进行Miseq测序得到的PE reads根据overlap关系进行拼接,同时对序列质量进行质控和过滤,区分样本后进行OTU聚类分析和物种分类学分析,进行绘制门与属水平上物种分布的柱状图,并计算每个样本中Alpha多样性指数,Alpha多样性指数包括能够反映物种群落丰富度的ACE指数和Chao1指数,以及能够反映物种群落多样性的Shannon指数和Simpson指数。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 21.0对试验数据进行统计分析,Duncan’s多重比较和T检验分析不同处理的影响差异,采用Origin 2019b 64Bit软件进行绘图,结构方程模型采用Amos 24.0软件绘制。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中培养料理化性状的变化

2.1.1 物理性状 如图1所示,CK与CS处理温度均在第1.5天进入第一个高峰,但CS处理升温快,且高温期持续时间更长。CS处理最高温度达到53.17 ℃,在第1天达到高温期(50 ℃),持续近4 d;而CK的最高温度为48.33 ℃,低于CS处理。

图1 两种发酵处理中培养料理化指标的变化Fig.1 Changes of physicochemical indexes of culture dishes in two fermentation treatments

堆制始期(第0天)CK和CS处理含水率相近,均在59%左右;第3天含水率降低至56%左右,CS处理比CK降幅更大;之后CS处理含水率持续增加,到第9天达到61%,CK含水率在第6天达最大值,第9天含水率降到最低水平(56%)。

两堆体体积质量在前3 d显著提高,第6天至第9天略低于第3天,但降幅很小,两处理差异不显著。

2.1.2 化学性状 由图1可知,从第0天～第9天,CK与CS处理的总有机碳含量(TOC)呈下降趋势,且二处理间差异不显著;而二者的全氮(TN)含量却呈上升趋势,导致C/N比降低。CS处理的的电导率总体呈上升趋势,第9天的电导率为2 630 μS·cm-1,比第0天提高34.8%; CK处理的电导率总体呈下降趋势,第9天的电 导率为1 630 μS·cm-1,低于第0天(1 810 μS·cm-1)。

从整个发酵进程来看,CK处理的铵态氮含量总体呈下降趋势,至第9天时,铵态氮含量为0.35 g·kg-1,低于初始的铵态氮含量(0.38 g·kg-1),但二者差距不大;而CS处理的铵态氮含量总体呈上升趋势并在第3天达到峰值(0.38 g·kg-1)。在发酵进程中,CK与CS处理pH均呈提高的趋势,且CS处理始终高于CK,第0天两处理pH相近,第9天CK和CS处理pH分别提高到7.31和7.65。补充氮源的种类不同,使得堆体内微生物群落的组成有所差异,导致了两处理理化性质也存在一定差异。

2.1.3 理化因子之间的相互作用 图2为CK与CS处理的结构方程模型,在CK中x2= 2.480,df=1,GFI=0.937;在CS处理中x2=0.023,df=1,GFI=0.999。(GFI:Goodness of Fit Index拟合指数;df:Degrees of Freedom自由度)。从结构方程模型可知,与CK相比,添加玉米浆作为补充氮源使得理化性质间的关系发生了改变。在CK处理中,温度对全氮具有显著的负面影响,体积质量对全氮具有显著的正面影响,总有机碳对铵态氮具有显著的正面影响。在CS处理中,温度、电导率对铵态氮具有显著的正面影响,电导率对全氮具有显著的正面影响,总有机碳对铵态氮具有显著的正面影响。

实线和虚线箭头分别表示显著和不显著的关系。与箭头相邻的数字是标准化的路径系数,类似于相对回归权重,并指示关系的效应大小。箭头宽度与关系的强度成正比。*P<0.05,** P<0.01,*** P<0.001。模型拟合状况良好。GEI>0.9,则代表模型拟合状况良好

2.2 高温期细菌群落变化

2.2.1 细菌OTU变化 按照97%相似性对非重复序列(不含单序列)进行OTU聚类,从CK处理和CS处理序列中分别获得约471个OTU和393个OTU。韦恩图能够比较直观的反应出两个处理中细菌微生物群落组成相似性以及重叠情况。如图3所示,添加玉米浆的CS处理与CK处理之间共有363个相同的细菌OTU。其中,CS处理中含有特异的细菌OTU数量为30个,而CK中含有特异的细菌OTU数量为108个,约为CS处理中得3.6倍。

图3 细菌微生物群落OTU的韦恩图Fig.3 Venn diagrams of bacterial microbial OTU

2.2.2 细菌微生物多样性 Alpha多样性指数是反映单个样品的丰富度和均匀度的综合指标,有多个衡量指标。如表2所示,CK处理的Simpson指数显著低于CS处理。而CS处理的ACE,Chao1和shannon指数与均显著低于对照,说明CS处理内微生物群落的丰富度比CK低。

表2 不同处理的细菌多样性指数Table 2 Bacterial diversity index of different treatments

2.2.3 细菌群落相对丰度的变化 从图4可知,两处理门水平上都鉴定出4个优势门,分别为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)、放线菌门(Actinobacteriota)和厚壁菌门(Firmicutes),但不同处理的菌群丰度存在较大差异。在CK处理中占相对优势的菌门为变形菌门、拟杆菌门、放线菌门以及厚壁菌门,其相对丰度分别为45.59%、33.4%、11.7%以及7.39%。同样地,在CS处理中占主要优势的是变形菌门,相对丰度为58.91%;其次是放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门,相对丰度分别为24.11%、11.91%和2.97%。在CS处理中,拟杆菌门相对丰度降低,其余菌门相对丰度均有所增加。

相对丰度算法:A/B×0.01,A代表这个样本某个属的克隆序列,B代表在这个样本中所有属的克隆序列

2.2.4 高温期优势细菌菌属组成的差异 如图5所示,在高温期采集的样本中,鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)和不动杆菌属(Acinetobacter)在CK中的相对丰度显著高于在CS处理中的相对丰度,为CK处理中的优势属。芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、海藤黄色单胞菌属(Luteimonas)和螯台球菌属(Chelatococcus)在CS处理中的相对丰度显著高于其在CK中的相对丰度,为CS处理中的优势属。高温期细菌微生物在门和属水平上相对丰度的变化可能与玉米浆中含有较多的有机营养物质有关。

图5 两种发酵堆体内细菌微生物群落的变化Fig.5 Changes of bacterial microbial communities in two fermentation reactors

2.3 理化性质与微生物间的关系

由表3可知,芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属均属于厚壁菌门,两菌属与pH、电导率显著正相关,与体积质量呈显著负相关。芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属具有分解纤维素的能力,可以加快堆肥的反应进程。海藤黄色单胞菌属属于变形菌门,它与全氮显著正相关,与碳氮比显著负相关;其属于反硝化细菌,可在一定程度上提高堆体的全氮含量[20]。链霉菌属属于放线菌门,与pH、电导率呈显著正相关。橄榄形菌属与全氮呈显著负相关;与碳氮比呈显著正相关。其具有降解芳香族化合物功能[21],在升温期大量繁殖,可分解物料中的纤维素及半纤维素,导致C/N发生变化。

表3 理化性质与微生物间相关性分析Table 3 Correlation analysis between physical and chemical properties and microorganisms

3 讨 论

在发酵过程中,生物分解物料中有机物的同时会产生大量的热量,温度是堆体发酵过程中一个非常重要的指标,微生物活动越旺盛,产热越多,进而堆体温度也越高[22]。在发酵过程中,CS处理的最高温度高于CK处理,且高温期持续时间更长,这可能与玉米浆的成分有关,玉米浆中含有多种易被降解的氨基酸、蛋白质和可溶性糖等有机成分,为微生物的繁殖提供最初的营养物质,促使微生物大量繁殖,进而加速植物残体的降解速度,因此产热越多。堆体在发酵第3天温度达到最高,高温导致水分大量蒸发,使堆体整体含水量降低。堆体含水量极大地影响着堆体的通气状况(体积质量),进而影响微生物的活性和物料的降解速度。随着堆制过程的推进,发酵后期有机物被分解,微生物活动分解植物残体产生的大量H2O因堆体不再高温而保留,未散发的水分使得堆体含水量升高;与CK相比,CS处理由于其微生物活动旺盛,有机物分解更为彻底,分解过程中释放更多水分,导致CS处理堆体含水量持续增加;CK处理在第6天堆体温度已经降到最低 (28.5 ℃),有机物分解速度变慢,有机物分解过程中产生的水分不在增加,但堆体表面水分蒸发不可避免,导致第9天堆体含水率更低。

本研究中体积质量的变化趋势与Rajpal等[23]的研究结果一致。造成这一现象的原因可能是新鲜蓬松的玉米秸秆变成半分解的有机物料,原有结构被破坏,使原本疏松的结构变得紧实。在本研究中,全氮含量一直呈上升趋势,这与苏鹏伟等[24]的研究结果相似,这是由于玉米浆中含有大量含氮物质,矿化作用的速度相对缓慢,氮素挥发损失较少,且随着培养料中有机物质不断被分解,干物质含量不断下降,故造成单位干物质中全氮的相对含量增加。TOC降低和电导率上升与堆体内有机物的降解有关,随着发酵进程的推进,大量有机物被分解,同时产生大量的无机盐,导致电导率升高。CS处理铵态氮含量高的原因可能与堆体中含有大量的蛋白质态氮有关,玉米浆中含有大量的可溶性蛋白质态氮、氨基酸和水解酶,在氨化过程中产生大量的铵态氮,铵态氮促进有机氮的转化,酰胺态氮的作用次之[25],而CK处理外源氮为尿素(酰胺态氮),有机氮降解相对缓慢;堆体pH升高可能与铵态氮的大量释放有关[26]。

在本次研究中,变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门是发酵过程中最丰富的细菌菌群,这与Meng等[27]的研究一致,它们代表总鉴定序列的90%以上的菌群群落。由于玉米浆中含有丰富的营养物质,为微生物的活动提供充足的能源,加速微生物对有机物的降解,导致CS处理比CK处理更早进入高温期,而放线菌群与厚壁菌群可在高温环境中具有良好的生存能力,因此CS处理与CK处理相比,能更好的降解木质纤维素。温度较高可能会导致一部分不耐高温的微生物失活,进而使CS处理内的微生物的群落多样性低于CK处理。而CS处理内的pH与CK处理相比,更接近弱碱性,更有利于微生物进行代谢等活动[21]。在前人的研究中曾指出,厚壁菌可在高温下生长,并广泛分布于发酵的高温阶段[28],这与本研究的结果相似。CK处理较CS处理堆体具有更多的特异性细菌微生物生物类群。与CK处理相比,CS高温期的温度较高,而细菌对于环境的变化很敏感[29],此时CS堆体内嗜温微生物的活性不断下降,嗜热微生物的活性增强,并取代嗜温微生物成为优势菌属,从而导致堆体内微生物多样性降低[30]。

4 结 论

在大球盖菇培养料建堆发酵过程中,以玉米浆或尿素作为氮源都会导致堆体温度上升、体积质量增大、pH升高、碳氮比降低;但与对照相比,添加玉米浆能够改变发酵堆的理化性质,使发酵温度上升更高,高温期更长,电导率和全氮含量升高。使电导率与全氮和铵态氮含量正相关;并改变高温期细菌群落的相对丰度,在一定程度上促进变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)和厚壁菌门(Firmicutes)的生长,同时又抑制拟杆菌门(Bacteroidota)的生长,使具有分解纤维素、固氮功能的菌属显著升高成为优势菌属,在一定程度上促进氮循环,更有利于秸秆腐熟发酵。这些结果为研究玉米秸秆和玉米浆发酵中优势属的潜在功能提供参考。