非洲猪瘟病毒重组载体疫苗激发/加强免疫策略的初步研究

周晓慧,卢会鹏,张鑫宇,夏晓莉,孙怀昌

(1.扬州大学 兽医学院,江苏省重要动物疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏扬州 225009;2.江苏农牧职业技术学院,江苏泰州 225300)

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是目前威胁世界养猪业非常重要的传染病[1]。由于尚无安全、有效的疫苗,该病只能靠早期诊断、感染猪扑杀和生物安全措施进行控制,但不足以控制该病的广泛流行[2]。非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)疫苗研究的重点是基因缺失苗和重组病毒载体疫苗,其中基因缺失苗是短期内较有希望的疫苗,免疫猪可以抵抗同源毒株的攻击,但多不能抵抗异源毒株的攻击,而且存在基因重组、毒力返强和病毒扩散等生物安全风险[3];重组载体疫苗是ASFV疫苗研制的长期目标,重点研究免疫保护性抗原基因及其传递方式,但相关研究很少[4-5]。

已经用于ASFV重组载体疫苗研究的病毒载体主要有腺病毒、痘苗病毒和伪狂犬病毒。其中,重组腺病毒载体疫苗用人腺病毒5型进行,可以感染猪等哺乳动物的多种细胞,抗原基因的表达水平较高,但容易产生抗载体免疫而影响疫苗的再次免疫[4];重组痘苗病毒载体疫苗用遗传改造型安卡拉株进行,具有很好的安全性和较大的外源基因装载容量,但诱导的免疫应答以细胞免疫为主[6-7];重组伪狂犬病毒载体疫苗具有安全性好、免疫周期长、成本低等优点,且该病毒载体可以同时插入多个外源基因,具有实现一针多防的目的优势。应用弱毒疫苗株构建的重组病毒,免疫后可以诱导较好的体液免疫、细胞免疫以及粘膜免疫[8],是一个极具潜力的病毒活载体疫苗。

重组载体疫苗的激发/加强免疫策略可用相同和不同的病毒载体进行。其中,不同载体组合的免疫策略可以减轻抗载体免疫,并能诱导较全面的免疫应答,但具体的载体组合需要进行筛选[9-11]。为此,本研究构建表达ASFV CD2v-p30-p54融合抗原的重组伪狂犬病毒rPRV-F1,将其与表达相同融合抗原的重组腺病毒(rAd-F1)组成4个组合进行猪免疫试验,旨在筛选较好的ASFV重组载体疫苗的激发/加强免疫策略。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪外周血单个核细胞(PBMC)分离液购自天津灏洋生物制品有限公司;ASFV荧光PCR检测试剂盒购自青岛立见公司;猪干扰素γ(IFN-γ)ELISA检测试剂盒购自上海远慕生物科技有限公司;RPMI 1640细胞培养液购自美国Thermo scientific公司;胎牛血清(FBS)购自上海双洳生物科技有限公司;刀豆蛋白A(ConA)购自美国Thermo scientific公司;肝素钠抗凝采血管购自山东永康生物科技有限公司;HRP标记羊抗猪IgG抗体购自英国Abcam公司;TMB显色液购自碧云天生物科技有限公司;高保真PCR酶与限制性内切酶购自宝日医生物技术有限公司;DH5α大肠杆菌、真核表达载体pcDNA3.0、PK-15、HEK-293A和BHK-21细胞系为扬州大学孙怀昌课题组保存;HNX株PRV由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供;ASFV抗体阳性血清由扬州大学农业部重点开放实验室(P3实验室)提供;ASFV融合基因F1(CD2v-p30-p54、 1 992 bp)由上海生工生物工程股份有限公司合成;表达ASFV融合基因CD2v-p30-p54的rAd-F1由扬州大学孙怀昌课题组构建[12];ASFV p54、p30和CD2v重组抗原由扬州大学孙怀昌课题组制备。

1.2 PRV同源重组载体的构建

用PvuⅡ酶切法切除pcDNA3.0载体的NEO表达盒,插入多克隆位点和P2A自裂解肽编码序列(GenBank: MT559572.1)后的改造载体命名为pcDNA3-2。根据HNX株PRV的TK基因序列(GenBank:KM189912.1)设计PCR引物(表1),利用酚/氯仿抽提法从PRV感染PK-15细胞提取病毒基因组DNA,以提取的DNA为模板,用高保真PCR酶扩增TK基因的左、右同源臂,插入pcDNA3-2载体后获得的同源重组载体命名为pTK。根据绿色荧光蛋白(GFP)基因设计1对引物(表1),反向引物引入Flag标签,以pEGFP-C3(GenBank: U57607.1)载体为模板进行PCR扩增,克隆入pTK载体后获得的同源重组载体命名为pTK-GFP。利用NheI和EcoRV双酶切法将F1融合基因从pShuttle-F1载体上切下,插入pTK-GFP后获得的同源重组载体命名为pTK-F1,其融合基因表达盒的结构如图1所示。

表1 本研究使用的PCR引物Table 1 PCR primers used in this study

1.3 重组PRV的制备

重组PRV-F1的制备按照文献[13-14]的方法进行。将BHK-21细胞接种6孔细胞培养板,培养至80%满层后,按照LipofectamineTM3000 Reagent说明书进行基因转染,同源重组载体为1.5 μg/孔,PRV基因组DNA为1 μg/孔。当80%转染细胞出现病变时反复冻融3次,离心后取上清液进行连续10倍稀释,再次接种BHK-21细胞后用1%低熔点琼脂糖覆盖,如此进行3轮病毒噬斑纯化。

在细胞培养皿(底面积为8 cm2)中将BHK-21细胞培养至80 %满层。用含2 %FBS的RPMI1640培养基将纯化的重组PRV-F1进行连续10倍稀释,分别取10-4mL-1、10-5mL-1和10-6mL-1的病毒稀释液10 μL加入培养皿,每个稀释度设8个重复,感染后1 h吸弃病毒液,各皿用预热至37 ℃的1%低熔点琼脂糖覆盖,凝固后在CO2培养箱内培养48 h,在荧光显微镜下计数各皿的绿色荧光噬斑数,计算重组病毒的滴度。

1.4 重组PRV的鉴定

在24孔板培养PK-15细胞,培养12 h后用rPRV-F1感染(MOI=0.5)。感染后24 h吸弃病毒液,细胞用含5 %脱脂乳粉和0.05%Tween20的PBS在37 ℃封闭1 h,依次用ASFV抗体阳性血清(1∶100)和FITC标记羊抗猪IgG(1∶2 000)进行免疫荧光染色,经DAPI反衬染色后进行荧光显微镜观察。在70%感染细胞出现病变时,将细胞培养物反复冻融3次,SDS-PAGE分离后转印硝酸纤维素膜,依次用ASFV抗体阳性血清(1∶500)和HRP标记羊抗猪IgG(1∶10 000)进行免疫印迹检测。

1.5 试验猪的免疫方案

将15头21日龄ASFV双阴性、PRV阴性[15-16]且未进行PRV疫苗接种的断奶仔猪平均分为5组(n=3),第一组为rAd-F1/rAd-F1激发/加强免疫组,第二组为rPRV-F1/rPRV-F1激发/加强免疫组,第三组为rAd-F1/rPRV-F1激发/加强免疫组,第四组为rPRV-F1/rAd-F1激发/加强免疫组,免疫剂量均为107PFU/头,免疫途径为肌肉注射,激发免疫后第21天加强免疫1次,第五组为非免疫对照组。免疫后第0、7、21、28、42、56天采集抗凝血用于PBMC分离和IFN-γ检测,采集非抗凝血用于血清分离和抗体检测。

1.6 IgG抗体检测

免疫猪的抗体检测用常规间接ELISA进行,每样品设3孔重复;包被抗原分别为ASFV CD2v、p30和p54重组抗原(2.5 μg/mL),其中CD2v抗原是大肠杆菌表达的CD2v胞内区蛋白片段[17],37 ℃包被1 h;封闭液为含5 %脱脂乳粉和0.05 %Tween 20的PBS,37 ℃封闭1 h;免疫猪血清稀释倍数为1∶200,37 ℃孵育1 h;HRP标记羊抗猪IgG稀释倍数为1∶10 000, 37 ℃孵育1 h;加入TMB底物,室温避光显色15 min;用1 mol/L硫酸终止反应,立即用酶标仪读取各孔的OD450值;以P/N>2.1为判定标准,用Graphpad软件对各组的抗体水平(OD450平均值)进行统计学分析,用Excel 2021软件进行柱形图绘制。

1.7 IFN-γ检测

分别在免疫后第0、7、21、28、42和56天采集试验猪的抗凝血,按照外周血淋巴细胞分离试剂盒说明书进行PBMC分离;用细胞培养液将细胞调整为5×106个/mL,分装96孔细胞培养板,100 μL/孔;分别加入ASFV p54、p30和CD2v重组抗原(10 μg/mL),100 μL/孔,每样品设3孔重复,设Con A(5 μg/mL)阳性对照和细胞培养液阴性对照;37℃刺激72 h后吸取各孔细胞培养上清,5 000 g离心10 min后吸取上清液,按照ELISA检测试剂盒说明书进行猪γ干扰素检测,设空白对照孔和标准品孔,以标准品浓度为横坐标、OD450值为纵坐标绘制回归曲线,根据曲线方程计算公式(R≥0.990 0)计算各孔的IFN-γ 浓度。

2 结果与分析

2.1 PRV同源重组载体的鉴定

对构建的PRV同源重组载体pTK-F1进行酶切鉴定,琼脂糖凝胶电泳显示能切出插入的 1 992 bpF1融合基因。对重组质粒DNA进行测序,结果显示插入的F1基因无突变(图2)。

图2 融合基因的序列分析Fig.2 Analysis offusion gene sequence

2.2 重组PRV的制备

在同源重组载体与PRV基因组DNA共转染后48 h收集细胞裂解液,经3轮病毒噬斑纯化后可见典型的PRV噬斑,荧光显微镜下观察的病毒噬斑为GFP阳性(图3)。根据病毒噬斑数计算的rPRV-F1滴度为2.3×109TCID50/mL。

2.3 重组PRV的表达检测

分别用rPRV-F1和rAd-F1感染细胞,感染后24 h用ASFV抗体阳性血清进行免疫荧光检测,结果显示两个重组病毒感染细胞均为免疫荧光检测阳性(图4)。分别用rPRV-F1和rAd-F1感染细胞,设PRV和rAd感染对照组,感染后36 h用ASFV抗体阳性血清进行Western blot检测,结果显示rPRV-F1和rAd-F1感染细胞均能检测到预期的约128 ku F1融合蛋白,而PRV和rAd感染细胞不能检测到蛋白条带(图5-a和5-b);用Flag单克隆抗体进行免疫转印检测,结果显示rPRV-F1感染细胞能检测到P2A裂解释放的GFP-Flag融合蛋白,而PRV感染细胞未能检测到蛋白条带(图5-c)。

图4 重组病毒感染细胞的免疫荧光检测Fig.4 Immunofluorescence of recombinant virus-infected cells

图5 重组病毒感染细胞的Western blot 检测Fig.5 Western blotting analysis of recombinant virus-infected cells

2.4 试验猪的抗体检测

从免疫后第7天起,所有免疫猪均能检测到抗原特异性IgG抗体,加强免疫后的抗体水平显著升高(图6)。在初免后第7天,rAd-F1/rAd-F1和rAd-F1/rPRV-F1免疫组的CD2v抗体水平高于其他两组(P<0.05),p30抗体水平显著高于其他两组(P<0.01),4个免疫组的p54抗体水平无显著差异;在初免后第21天,rAd-F1/rAd-F1免疫组和rAd-F1/rPRV-F1免疫组的CD2v抗体水平高于其他两组(P<0.01或0.05),p30和p54特异抗体水平显著高于其他两组(P< 0.05);在初免后第28天(加强免疫后第7天),rPRV-F1/rAd-F1免疫组的CD2v抗体水平显著高于其他3组(P<0.05或0.01),rAd-F1/rPRV-F1和rPRV-F1/rAd-F1免疫组的p30抗体水平显著高于其他两组(P<0.05),rAd-F1/rAd-F1免疫组的p54抗体水平显著高于其他3组(P<0.05或0.01);到免疫后第56天(加强免疫后第21天),rPRV-F1/rAd-F1免疫组的CD2v抗体水平显著高于其他3组(P<0.05或0.01),rAd-F1/rPRV-F1和rPRV-F1/rAd-F1免疫组的p30抗体水平显著高于其他两组(P< 0.01),rPRV-F1/rAd-F1免疫组的p54抗体水平显著高于其他3组(P<0.05或0.01)。

图6 免疫猪的抗原特异性抗体检测Fig.6 Detection of antigen-specific antibodies in pigs immunized with different strategies

2.5 试验猪的γ干扰素检测

在免疫后不同时间采血分离PBMC,分别用ASFV CD2v、p30、p54重组抗原刺激72 h,细胞培养上清检测结果显示,从免疫后第7天起所有免疫猪均能检测到抗原特异性γ干扰素,加强免疫后的γ干扰素表达水平显著升高(图7)。在免疫后第7天,4个免疫组的3种抗原特异性γ干扰素表达水平无显著差异;在初免后第21天,4个免疫组的CD2v特异γ干扰素表达水平无显著差异,rAd-F1/rAd-F1和rPRV-F1/rAd-F1免疫组的p30和p54特异γ干扰素表达水平高于其他两组(P<0.05);在初免后第28天(加强免疫后第7天),rPRV-F1/rAd-F1免疫组的CD2v特异γ干扰素表达水平显著高于其他3组(P< 0.05),rAd-F1/rAd-F1和rPRV-F1/rAd-F1免疫组的p30特异γ干扰素表达水平显著高于其他两组(P<0.05),4个免疫组的p54特异γ干扰素表达水平无显著差异;到免疫后第56天(加强免疫后第21天),rPRV-F1/rAd-F1免疫组的CD2v特异γ干扰素表达水平显著高于其他3组(P<0.01或0.001),p30和p54特异性γ干扰素表达水平也显著高于其他3组(P<0.05或0.01)。

图7 免疫猪PBMC的抗原特异性γ干扰素检测Fig.7 Detection of antigen-specific IFN-γ in PBMC from immunized pigs

3 讨 论

ASFV重组载体疫苗的研究重点包括免疫保护性抗原及其传递方法的选择[18-19]。为此,本研究在构建rPRV-F1基础上,将其与表达相同融合基因的rAd-F1组成4个组合进行猪免疫试验,旨在筛选合理的ASFV重组载体疫苗的激发/加强免疫策略。为了便于rPRV-F1的筛选与纯化,本研究利用P2A自裂解肽将ASFV融合抗原与GFP-Flag隔开,不仅可以在荧光显微镜下直接进行GFP阳性病毒噬斑的挑选,而且P2A裂解释放的F1融合抗原可以独立诱导免疫应答。另外,rPRV-F1感染细胞表达的F1融合蛋白较预测分子质量大48 ku,可能与其中CD2v和p54的糖基化修饰有关[20-21]。

在测试的4个免疫方案中,尽管rAd-F1/rAd-F1组合初次免疫后的抗原特异性抗体水平最高,但加强免疫后的抗体水平最低(p54抗体水平除外),可能与rAd强免疫原性及其诱导的抗载体免疫有关[20]。相反,尽管rPRV-F1/rAd-F1组合初次免疫后的抗原特异性抗体水平最低,但加强免疫后的抗体水平最高。在F1融合蛋白中,CD2v是ASFV的血吸附蛋白,自然感染猪的血吸附抑制抗体水平很低,据此认为CD2v是弱免疫原性蛋白,可能与细胞CD2分子的序列同源性有关[22-24]。但在本研究中,所有免疫猪的CD2v抗体水平与p30和p54抗体水平相似,可能与使用CD2v胞内区蛋白片段作为检测抗原有关,因为CD2v胞内区与细胞CD2分子无序列同源性,利用CD2v胞内区重组抗原可以在ASFV感染猪检测到高水平的特异抗体[17]。

γ干扰素是ASFV的保护性免疫指标之一[25]。本研究结果显示,所有免疫猪的PBMC均能检测到抗原特异性γ干扰素表达,而且加强免疫后的γ干扰素浓度明显升高。在测试的4个免疫方案中,尽管rAd-F1/rAd-F1组合初次免疫后的抗原特异性γ干扰素表达水平最高,但加强免疫后的γ干扰素表达水平最低,进一步证明与rAd诱导的抗载体免疫有关。相反,尽管rPRV-F1/rAd-F1组合初次免疫后的抗原特异性γ干扰素表达水平最低,但加强免疫后的γ干扰素表达水平最高。

综合考虑抗原特异性抗体和γ干扰素应答两项指标,本研究结果表明rPRV/rAd组合是较好的ASFV重组载体疫苗的激发/加强免疫策略。