家蚕病毒病抗性研究进展

高瑞娜

(朔州职业技术学院,山西朔州 036000)

病毒性蚕病发病率高、传染性强、防治难度大、危害严重,每年因蚕病暴发造成的损失占蚕业生产总收入的20%左右,由家蚕核型多角体病毒、家蚕质型多角体病毒和家蚕浓核病毒侵染引发的三大病毒病造成的损失占蚕病总损失的80%左右[1]。因病毒种类和寄生部位不同,目前生产上常见的病毒病主要有家蚕核型多角体病毒病(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus,BmNPV)、质型多角体病毒病(Bombyxmoricytoplasmic polyhedrovirus,BmCPV)、浓核病(Bombyxmoridensonuclopsisvirus,BmDNV)和软化病(Bombyxmoriinfectious flacherie virus,BmFV),其中寄生于各种组织细胞核形成多角体的为核型多角体病毒,寄生于中肠细胞的细胞质形成多角体的为质型多角体病毒,寄生于中肠杯形细胞、中肠前段呈空头的为软化病病毒。浓核病病毒是从软化病病毒分离鉴定出来的一株病毒,发病与软化病病毒类似[2]。现对近十年来的家蚕病毒病的研究成果进行综述,希望对家蚕抗性理论研究提供参考,对抗病毒药物研发提供新的思路。

1 家蚕抗核型多角体病毒的研究

1.1 抗性品种的选育

徐安英[3-4]等人通过传统的杂交技术培育了耐家蚕核型多角体病毒病蚕品种“华康2号”,并通过桑叶涂抹法添食,发现新选育的品种及其杂交种对BmNPV的LC50均超过1×109个/mL,高于对照组2个或3个数量级以上,充分说明了新品种对BmNPV具有很强的抵抗性。该团队于2021年又培育出了家蚕抗血液型脓病品种华康3号,该新品种综合性状优良、体质强健、抗脓病性能强,对BmNPV多角体的LC50均超过5.41×1011个/mL,深受蚕农和丝厂的喜爱[5]。邵榆岚[6]等人对云南蚕区200个家蚕品系进行了抗性研究,发现731、795、854B、872A、966B、B黄肉色茧、P50、山河B、选二甲白和竹印为抗性品种,但大多数抗BmNPV能力属于中等水平,其中P50为BmNPV抗性最强品种。唐芸[7]等开展了对湖南蚕区品系洞·庭×碧·波抗血液型脓病能力的改造,并育成了1对具有很强抗血液型脓病的家蚕新品种华·康×湘·泰,通过多角体悬浮液经口添毒试验显示,新品种华·康×湘·泰的各种级家蚕对BmNPV多角体的半致死浓度(LC50)值均在1×109个/m L以上,具有明显优势。董战旗[18]等人还对家蚕抗性品系NC99R进行口服感染和体腔注射BmNPV包涵体,研究了其抗BmNPV的分子机制。

CRISPR/Cas9介导的基因编辑已经被证明可以通过破坏病原体的基因来有效地抑制感染[9]。西南大学的DONG Z等[10]学者构建了表达CRISPR/Cas9的4个家蚕转基因系和以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)为目标的sgRNA,研究证明了Cas9(C)/sgRNA(C)转基因系有效地编辑了家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组的目标位点,并在BmNPV感染后观察到大片段缺失。对该转基因系的抗病毒分析也进一步表明,半致死剂量(LD50)比正常接种包涵体后的值高出1 000倍。表明CRISPR/Cas9介导的基因编辑可以更有效地靶向家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组,可作为一种昆虫抗病毒的新方法。

1.2 抗性功能基因的研究

云南农大唐芬芬[11]等发现短时热激能够提高家蚕对BmNPV的抗性,猜测热激蛋白基因Bmhsp25.4和抗菌肽基因Bmglve2可能在家蚕热激响应的抗病毒免疫中发挥关联功能。

江苏科技大学研究团队发现BmNPV可诱导上调家蚕miRNA(bmo-miR-217)的表达水平,bmo-miR-217又可显著下调BmNPV的主要复制基因lef-1的表达,因bmo-miR-217基因表达量的变化是家蚕先天免疫的一种有效策略[12]。宋秋云[13]通过RNA干扰技术使宿主细胞BmTret1-X1基因沉默后发现siRNA、gp64在病毒侵染后有一定水平的表达上升,显著促进BmNPV病毒基因的表达,这也说明BmTret1-X1基因在抗病毒方面具有一定的作用。高娟[14]等用BmNPV悬浊液浸渍的桑叶攻毒,发现对BmSMYD4-X1基因表达的影响作用不明显,没有病毒侵染诱导表达现象,但过表达BmSMYD4-X1基因条件下,lef-3、vp39和p10这些关键基因从病毒感染6 h开始出现表达抑制,通过RNA干扰BmSMYD4-X1对BmNPV病毒增殖效率也无明显影响。研究者推测BmSMYD4-X1基因高表达可能是宿主家蚕对BmNPV抵抗性的分子机制之一。有研究学者通过免疫印迹检测发现BiP在家蚕核型多角体病毒BmNPV感染的细胞中表达上调,通过RNA干扰技术敲低该基因的表达后,感染效率也显著降低。

西南大学研究团队[16]在Bm N-SWU1细胞中过表达BmNPV核衣壳蛋白VP39,发现VP39会影响BmNPV的扩散,从而导致BmNPV感染细胞数目大量减少。该团队[17]在对家蚕品系871与871C抗家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的差异及机制研究中又发现BmCLT-S5具有显著抑制BmNPV复制增殖的能力。2020年,该团队[18]又发现BmNPV病毒感染家蚕后,会通过增强p-Akt蛋白从而抑制BmFoxO的表达,过表达BmFoxO后会诱导BmPEPCK-2上调表达,从而促进细胞受到病毒感染后的自噬与凋亡免疫途径,从而抑制BmNPV病毒的繁殖,降低病毒拷贝数和家蚕死亡率。

江苏大学研究团队[19]通过二代高通量测序技术,对BmNPV抗性品系NB和感性品系306亲本进行简化基因组测序,共获得62 185个标记,进行基因结构分析、连锁分析、克隆测序分析后发现有2个酯酶基因发生突变,添毒后24 h中肠内膜系统的V-ATPase酶活性也出现升高,表明V-ATPase为BmNPV抗性基因。2018年,该研究团队[20]又发现家蚕BmSocs2基因在抗性品系和感性品系中表达量有差异,生物信息学分析发现BmSocs2基因可能在Jak-STAT信号通路中发挥着重要作用。通过构建含BmSocs2目的基因的重组真核表达质粒转染家蚕卵巢细胞BmN,体外过表达实验研究,结果显示在细胞水平上家蚕BmSocs2基因确实在抗BmNPV侵染的过程中发挥了重要作用。

Hu[21]等发现丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A(PP2A)定位于家蚕细胞质中,在家蚕表皮和中肠中均有高表达,家蚕核多角体病毒(BmNPV)感染可诱导其表达下调,反过来通过过表达上调该基因又可显著抑制BmNPV的增殖,通过RNA干扰和PP2A抑制剂治疗下调BmPP2A,可增加BmNPV的复制。这充分说明PP2A在家蚕中具有抗病毒作用。

1.3 抗性功能蛋白的研究

廖金旭[22-23]等发现家蚕胸腺素BmTHY是家蚕重要的免疫因子,BmNPV感染可降低蚕体及部分组织中该基因转录与蛋白质表达水平,能够与actin互作影响微管蛋白的结构和功能,从而抑制BmNPV病毒的增殖和复制。且高剂量r Bm THY添食处理可以在一定程度上提高家蚕抗BmNPV病毒感染的能力。

陈艳萍[24]通过SDS-PAGE、生物质谱和荧光定量PCR等技术分析发现BmNPV感染家蚕后围食膜蛋白质在感染不同时期发生不同的变化。该研究室查绪乐[25]后来也证实了家蚕围食膜因子会抑制BmNPV的增殖复制这一结论。他们通过系统发生分析、时空表达分析、基因敲除分析,发现家蚕围食膜因子Bm001504基因在幼虫期的中肠特异表达,而幼虫食下感染BmNPV后该基因的表达显著升高,过表达后感染BmNPV病毒关键基因ie1,vp39,p10的表达就受到抑制,家蚕幼虫感染BmNPV后的存活率也显著升高。

沙雷氏菌和多角体病毒本都是蚕的致病微生物,但西南大学研究团队却发现了沙雷氏菌分泌的一种次生代谢产物灵菌红素prodigiosin具有抑制多角体病毒的作用,有抗病毒活性,能显著地抑制子代病毒BV的产生,对BmNPV极早期基因ie-1、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录均有强烈的抑制作用,还可有效抑制BmNPV介导的膜融合。

1.4 表观遗传学的研究

高旭[27]通过q PCR以及WB检测显示家蚕感染BmNPV后,糖酵解途径中的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶Bm ALDO K42的乙酰化在DNA复制水平和蛋白质水平显著促进了病毒的增殖。2-脱氧葡萄糖(2-DG)是己糖激酶的抑制剂,能抑制细胞糖酵解在DNA复制水平和蛋白质水平,显著抑制了病毒的增殖。

黄昊凌[28]用家蚕细胞感染BmNPV 48-96 h后可诱导DNA甲基化酶(Dnmt)基因的表达,通过甲基化酶抑制剂Zeb作用后,显著降低了BmNPV滴度、BmNPV核衣壳蛋白39(VP39)的表达水平和BmNPVie-1及lef-3基因的拷贝数,同时对抗凋亡基因iap1的表达也有抑制作用。说明抑制DNA甲基化酶可以抑制BmNPV的增殖。

陈曦[29]等利用Red重组技术和Bac-to-Bac系统分别构建lef-6敲除型(lef-6-KO-Bacmid)和补回型(lef-6-RE-Bacmid)的病毒,再利用定点突变技术将赖氨酸(K)突变为谷氨酰胺(Q)模拟乙酰化修饰,将赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)模拟去乙酰化修饰,利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析病毒基因组的复制情况。结果发现lef-6-KO-Bacmid型病毒基因组拷贝数显著下降,2个赖氨酸位点的乙酰化修饰对病毒基因组复制也具有显著抑制作用(P<0.01),而去乙酰化修饰没有显著影响;病毒增殖能力检测和滴度分析结果也显示乙酰化修饰可以显著抑制病毒活力,降低子代病毒的产量;LEF-6乙酰化修饰对病毒晚期基因vp39转录具有显著抑制作用。

2 家蚕抗质型多角体病毒的研究

近年有研究对质型多角体病毒也做了大量的实验,发现了两个抗CPV的候选基因BmPGRP-S2和BmSCP1[30],其中BmPGRP-S2的增量表达可以通过激活Imd通路诱导抗菌肽基因升高,继而提高家蚕抗BmCPV能力,同时还不会影响家蚕的经济性状;而BmSCP1在感染初期就能抑制病毒,增量表达也不会影响家蚕的主要经济性状。彭正文[31]等人通过串联干涉病毒多个基因的方法制备了对BmCPV具有潜在抗性的转基因家蚕品系,而且该品系没有影响到家蚕的经济效益,还提高了家蚕抗性。也有学者[32]发现中肠细胞自噬在CPV病毒感染的早期具有一定的调节作用。

3 家蚕抗浓核病病毒的研究

有研究[33]将家蚕品系798感染BmBDV后,发现6个常见的家蚕抗病毒基因转录水平没有显著变化,而在其他品系中有上调或下调现象。说明家蚕品系798是抗家蚕BmBDV品系。

而通过高通量测序技术,发现家蚕品种JS口服感染BmBDV-ZJ的数字基因表达谱中,差异表达的基因绝大多数属于KEGG路径中和细胞质中DNA识别通路,其中编码RNA聚合酶III的基因有9个[34],这些基因都将成为后续研究的基础。

关于家蚕抗软化病病毒的研究甚少,这里不再进行综述。

4 家蚕抗病毒病的研究趋势

综上所述,已经有大量的工作分别从抗性品系选育、基因、蛋白质、表观遗传上对家蚕抗性进行了研究,也鉴定出了多个抗性品系和多个可能起抗病毒作用的基因和蛋白质,为最终解释家蚕抗病毒机制提供了重要的资料。但有的研究仅在基因转录水平发现变化就认为该基因是抗病毒基因,并没有用相应的蛋白水平进行验证;但也有研究应用了多种技术进行了基因-蛋白相互验证。因此,接下来的研究应该运用多种技术从基因和蛋白水平研究,证实筛选的基因或蛋白与家蚕抗性的相关性,确认其抗病毒功能。另外再通过 CRISPR/Cas9等技术,找到抗性基因或蛋白的上、下游作用因子,弄清楚家蚕抗病毒的详细机制,为抗病毒药物、抗病毒疫苗的研发提供新的思路。