微流控下“水包水”明胶亚微米粒的制备

吕 卉, 刘 孟, 肖新才

(中南民族大学药学院, 武汉 430074)

在药剂学上, 微米粒(microspheres, MS)给药指的是一种药物分子包裹于高分子材料的聚合物当中, 从而实现药物长时间稳定释放的缓控释药物传递系统. 常用的微米粒制备方式有搅拌法、乳化溶剂萃取法、相分离法、膜乳化法等[1-6], 以及微流控制备法. 在传统的制备方式中, 搅拌法得到的微米粒粒径分布不均, 相分离法、乳化溶剂萃取法等实验条件严格、操作繁琐、成本偏高[7]. 微流控技术相较于传统的技术工艺, 具有成本低、能耗低、操作简便、响应速度快等优点, 如今微流控技术被广泛应用于生产和生活的多个领域[8-11].

一般情况下, 当输入液体压力一定的情况下, 液体在管道内流动时, 如果管道横截面积变小, 流速也会相应增加, 因而产生剪切力[12]. 微流控装置就是利用第二相流速增加所产生的剪切力, 切断从针头流出的第一相液体, 第一相以微米粒的方式包裹在第二相液体中, 形成粒径可控、单分散性好的水包水、油包水或其他各种形式的微米粒[13]. 所谓“水包水”微米法是一种水溶性聚合物分散到另一种互不相溶的水溶性介质中形成的微米粒, 因而其最大特点就是在制备过程中避免了使用有毒性的有机试剂, 使微亚微米粒的生产制备及使用过程更加安全、环保[14-16].

明胶, 是天然高分子的亲水性物质, 具有无毒无害, 来源丰富, 生物可降解的特点, 同时明胶的来源广泛, 价格较为低廉, 因此是控释剂的理想载体, 拥有良好的应用前景[1,17-20]. 明胶不溶于乙醇, 也会与甲醛形成不溶于水的不可逆凝胶, 这为采用微流控设备制备“水包水”式微米明胶提供了可能[17]. 本实验中采用的是微流控装置, 利用了“水包水”离子凝胶化法制备明胶微米粒或者亚微米粒. 实验中第一相采用的明胶溶液, 第二相采用无水乙醇进行剪切, 最后收集产物后再使用甲醛进行固化[17]. 研究内容包括探讨第一相液体质量浓度、第一相针头伸入第二相针头的距离、明胶亚微米粒测量时间对粒径大小的影响、以及明胶亚微米粒固化方式对成品的影响. 期望实验数据为定量制备单分散纳米明胶粒提供支持.

1 实验部分

1.1 主要原料

明胶(gelatin): CP, 阿拉丁;甲醛, 水溶液(HCOH): AR, 上海国药;乙酸(CH3COOH): AR, 上海国药;无水乙醇(CH3CH2OH): AR, 上海国药.

1.2 明胶溶液的制备

在250 mL烧杯中, 将1 g明胶溶于100 g水中, 在40 ℃下搅拌24 h, 将所得溶液进行低压抽滤, 即得到实验所需的质量分数为1%明胶溶液. 调整溶于水中明胶的质量, 得到不同质量分数的明胶溶液.

1.3 明胶亚微米粒的制备

组装微流控装置, 第一相针采用30号针头(长度:50.8 mm, 外径:0.32 mm, 内径:0.14 mm, 端头内径:3.86 mm), 第二相针采用23号针头(长度:36.6 mm, 外径:0.63 mm, 内径:0.37 mm, 端头内径:3.86 mm). 在微流控装置中, 第一相液体采用明胶溶液, 第二相液体采用无水乙醇, 用注射器吸取两相液体, 注射器与第一相和第二相的液体输液管连接, 将注射器置于注射泵上, 设定好两台注射泵的参数, 使注射泵将两相液体固定的流速先后通入微流控装置中. 打开加热装置和蠕动泵, 使与微流控装置相连的冷凝管温度达到40 ℃(明胶溶液在常温下为固态, 40 ℃下为液态, 在实验过程当中需要尽可能使反应物以及产物保持在40 ℃). 再取一个洁净的100 mL空烧杯, 放置于40 ℃的恒温水浴锅中, 持续搅拌, 用于收集微流控装置挤出的明胶亚微米粒. 调整不同的条件, 如第一相的流速、第一相针头伸入第二相针头的距离、明胶亚微米粒的测量时间、明胶亚微米粒的固化方式、产物的处理方式等, 探索不同条件对明胶亚微米粒粒径的影响.

制得的明胶亚微米粒溶液中, 加入合适量的乙酸溶液用于调节溶液的pH值, 使溶液的pH值在4左右, 然后冷却溶液至室温. 在通风橱中, 冰浴条件下向溶液中缓慢滴加2 mL甲醛溶液, 溶液温度保持在0～5 ℃, 继续搅拌30 min, 室温下放置2 h 后, 得到固化后的明胶粒溶液.

1.4 正交实验的设计

根据实验制备方式, 选择明胶溶液质量分数(A)与第二相针头伸入第一相针头的距离(B)作为实验的考察因素, 每个因素设置5个水平进行正交实验, 正交实验设计表如表1、表2.

表1 明胶亚微米粒制备实验因素水平表

表2 明胶亚微米粒制备条件筛选方案

1.5 明胶亚微米粒的表征

取1.3中得到的固化后的明胶亚微米粒溶液200 μL, 加入1 800 μL的纯化水稀释明胶溶液, 用马尔文粒度仪(Nano ZSE, 上海思百吉仪器系统有限公司)测定稀释后的明胶亚微米粒的水力学半径.

取1.3中得到的固化后的明胶亚微米粒溶液, 在透射电子显微镜(TEM, TALOS F200X, Thermo Fisher Scientific)下观察明胶亚微米粒的表面形貌.

单分散性指数(polymer dispersity index, PDI)是用来表征聚合物粒径分散性指数, 计算公式如下:

(1)

其中,D90、D50和D10分别为微粒累积分布曲线中质量分数分别为90%、50%和10%时对应的颗粒直径.PDI值越小, 颗粒单分散性越好;反之则变差. 当PDI< 0.4时, 认为微球单分散性好[21]．

2 结果与分析

2.1 第一相明胶溶液的质量分数的影响

图2为明胶溶液质量分数与明胶亚微米粒粒径大小的关系. 在第一相流速固定为1 μL·min-1、第二相流速固定为350 μL·min-1、第一相针头伸入第二相针头的距离为7.5 mm等条件不变的情况下, 在一定范围内改变明胶溶液质量分数(如1%～3%), 即表2中实验1～5, 质量分数的改变对明胶粒径的影响不大, 且在质量分数为2%时, 单分散性指数最小且小于0.4, 说明此时明胶粒径分布较为均匀;当质量分数高于3%时, 测得明胶粒径数据较差, 此时明胶溶液更容易凝固并堵塞微流控装置, 故实验中不采用较大浓度的明胶溶液[22]. 而当质量分数小到0.5%时, 明胶粒径变大,PDI也较大, 说明此时明胶粒的单分散性差, 明胶粒径分布不均, 其原因可能是此时的明胶量不足以形成亚微米粒或亚微米囊.

图2 明胶亚微米粒粒径与明胶溶液浓度的关系Fig.2 Relationship between size of gelatin submicrospheres and concentration of gelatin solution

2.2 第一相针头伸入第二相针头距离的影响

图3为微流控装置内第一相针头伸入第二相针头(其距离为L)的示意图. 图4为第一相针头伸入第二相针头的距离与明胶亚微米粒的关系. 在第一相流速固定为1 μL·min-1、第二相流速固定为350 μL·min-1、明胶溶液质量分数分别为1%和2%的情况下, 明胶粒径大小随着L的改变有明显的变化, 即表2中实验6～15, 当L为7.5 mm时, 第二相液体从腔内进入针头, 液体流动时的横截面积改变最大, 液体的瞬时流速改变最大, 因而产生的剪切力最大, 此时明胶粒径最小. 而随着L的增加, 得到的明胶粒粒径和单分散性都随之增加, 这是因为伸入针头越长, 第二相流体的流场越发轴向, 剪切力越弱, 得到的亚微米粒尺寸越大[23]. 明胶溶液的质量分数不同,L对明胶亚微米粒粒径的影响也不完全相同, 再次证明小浓度的明胶溶液在亚微米粒或者亚微米囊形成过程中, 不容易成型.

图3 微流控装置内第一相针头伸入第二相针头的示意图Fig.3 Schematic diagram of the distance of the first phase needle extending into the second phase needle in the microfluidic

图4 第一相针头伸入第二相针头的距离与明胶亚微米粒的关系Fig.4 Relationship between the distance of the first phase needle and the second phase needle and gelatin submicrospheres

2.3 明胶粒测量时间对粒径大小的影响

表3为明胶粒测量时间与明胶粒径的关系. 由测量数据可得, 24 h后测得的明胶粒粒径数据比2 h后测得的明胶粒粒径偏大. 这是因为明胶粒在水溶液浸泡过程中容易溶胀.

表3 明胶粒测量时间与明胶粒粒径的关系

2.4 明胶亚微米粒固化方式的影响

表4为明胶粒粒径与明胶固化方式的关系. 在明胶溶液质量分数为1%、第一相流速固定为1 μL·min-1、第二相流速固定为350 μL·min-1、第一相针头伸入第二相针头的距离等条件不变的情况下, 改变固化的处理方式发现, 在烧杯中直接加甲醛溶液, 使产物滴入烧杯中直接固化方式得到的明胶亚微米粒粒径, 比收集产物后再加入甲醛溶液的固化方式所得到的明胶粒径较小, 但是产物滴入直接固化方式得到的明胶粒观察发现, 其粒径分布不均匀, 粒径差值较大, 可能因部分明胶未成球为小粒径颗粒, 部分明胶团聚成为大粒径物质.

表4 明胶粒粒径与固化方式的关系

2.5 对产物采用不同的处理方式的影响

在明胶溶液质量分数为1%、第一相流速固定为1 μL·min-1、第二相流速固定为350 μL·min-1、第一相针头伸入第二相针头的距离等条件不变的情况下, 本次实验以改变对明胶亚微米粒的处理方式, 来探求是否有使得明胶亚微米粒粒径不变的情况下, 除去明胶亚微米粒溶液中的有机溶剂的最优处理方式. 表5是对产物的不同处理方式与明胶亚微米粒粒径的关系. 由上述表可知, 通过不同的处理手段, 可知222.2 nm的亚微米粒在经过纯化水洗处理后得到的亚微米粒分布不均, 抽滤处理后可以得到粒径分布较为均匀的数据, 但明胶粒粒径较大, 与原样差值较大, 故两种方式均不能采用.收集时搅拌与不搅拌两种方式明胶粒粒径大小接近, 但收集产物时不搅拌的产物PDI较大于收集产物时搅拌, 固收集产物时, 收集产物时搅拌不会对明胶粒的形貌有较大的影响, 收集产物时不搅拌明胶粒会有一部分团聚.

表5 不同处理方式对明胶粒粒径的影响

2.6 优化实验的测量结果

通过以上的实验, 最后选取了质量分数为2%的明胶溶液, 控制微流控装置的第一相流速固定为1 μL·min-1、第二相流速固定为350 μL·min-1, 第一相针头伸入第二相针头的距离为7.5 mm等的实验条件制备明胶粒, 接取明胶粒溶液后, 再加入乙酸及甲醛溶液进行固化, 采用后固化的方式.在制备明胶亚微米粒的2 h后对固化后明胶粒溶液原样进行测量, 观测明胶粒的形貌.

图5制备得到的明胶粒溶液取200 μL, 加入1 800 μL纯化水稀释, 取稀释后的明胶粒溶液1 mL于马尔文粒度仪的塑料样品池中, 放入马尔文粒度仪中检测得到的明胶粒水力学半径. 从图中可得, 在以上实验条件下制备的明胶粒平均粒径为164.6 nm,PDI为0.155, 此时明胶粒粒径较小, 单分散性较好.

图5 明胶亚微米粒的水力学直径Fig.5 Hydraulic diameter of gelatin submicrospheres

图6为制备得到的明胶亚微米粒溶液原样在透射电子显微镜下得到的明胶亚微米粒的透射电子显微镜图. 图中显示制备的明胶亚微米粒粒径分布较为均一, 粒径约为145.2 nm, 考虑水力学作用, 结果与水力学直径相符．

图6 明胶亚微米粒的TEM图Fig.6 TEM diagram of gelatin submicrospheres

3 结语

本实验是通过改变不同的实验条件, 明胶溶液的质量分数、第一相针头伸入第二相针头的距离等, 以期找到一个最优的实验条件, 从而得到粒径较小, 分布较为均匀的明胶亚微米粒. 通过以上的实验可以发现, 当明胶溶液质量分数为2%, 第一相针头伸入第二相针头的距离为7.5 mm, 接取明胶亚微米粒溶液后固化, 直接测量产物固化后原样, 在制样的2 h后测样时, 可以得到粒径较小, 单分散性较好的明胶亚微米粒. 在以上的实验条件下制备明胶粒, 结果显示此条件下得到的明胶粒粒径较小, 单分散性较好, 分布均匀, 是制备明胶亚微米粒较为良好的实验条件.