异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌的分子分型和同源性分析

胡远芳 付明霞 王凤霞 李娜 梁进 王月玲 纪冰

摘要：目的 了解濱州医学院附属医院异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌（hVISA）的分子流行病学现状，为有效预防hVISA的传播提供依据。方法 采用万古霉素琼脂平皿筛选法对263株金黄色葡萄球菌进行初筛，菌群分析-曲线下面积（PAP-AUC）法对初筛阳性的hVISA可疑株进行确认。采用多位点序列分型（MLST）、葡萄球菌A蛋白基因（spa）分型和脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型方法对hVISA菌株进行分子分型和同源性分析。结果 本院初筛出113株hVISA可疑株，最终确认为hVISA的菌株共22株。MLST分型以ST72型（5株）为主，其次为ST59和ST25型（各4株）；spa分型主要为t002、t437以及t2431（各3株）。PFGE聚类分析共得到12种PFGE型别，命名为H1-H12型，相似值处于62.6%～100%之间，其中最主要的是H3型（共6株），其次为H1型（共4株）。结论    hVISA在本院为散发，22株hVISA菌株共检出10种ST型，14种spa型和12种PFGE型。本院hVISA菌株的主要流行克隆为ST72-t2431-H3型，且均来源于儿科，儿科可能存在ST72-t2431-H3型hVISA的流行。

关键词 异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌；多位点序列分型；葡萄球菌A蛋白基因分型；脉冲场凝胶电泳分型

中图分类号：R378.11  文献标志码：A

Molecular typing and homology analysis of heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus

Hu Yuan-fang1， Fu Ming-xia2， Wang Feng-xia1， Li Na1， Liang Jin1， Wang Yue-ling3， and Ji Bing1

（1 Department of Clinical Laboratory， Bingzhou Medical University Hospital， Binzhou 256600; 2 Department of Pathology， Binzhou peoples hospital， Binzhou 256600；3 Department of Clinical Laboratory， Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong First Medical University， Ji'nan 250021）

Abstract Objective To investigate the molecular epidemiological status of heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus （hVISA） in Bingzhou Medical University Hospital， and to provide evidence for effective prevention of hVISA transmission. Methods    263 strains of Staphylococcus aureus （S. aureu） were screened for hVISA by vancomycin brain heart infusion agar plate， and hVISA strains were validated by the modified population analyzed profile-area under the curve （PAP/AUC） method. The molecular typing and homology of hVISA strains were analyzed by multilocus sequence typing （MLST）， staphylococcal protein A （spa） typing and pulsed field gel electrophoresis （PFGE） typing. Results There were 113 screening positive strains in 263 strains of S. aureus， and 22 strains were confirmed to be hVISA positive by PAP/AUC. The MLST typing results showed that the strain types were mainly the ST72 type （5 strains）， followed by the ST59 type （4 strains）， and the ST25 type （4 strains）. The main types of spa were t002， t437， and t2431 （3 strains each）. PFGE cluster analysis revealed a total of 12 PFGE types， named H1-H12， with similarity ranging from 62.6% to 100%. Among them， H3 type was the most important （6 strains）， followed by H1 type （4 strains）. Conclusion hVISA was sporadic in our hospital， and a total of 10 ST types， 14 spa types， and 12 PFGE types were detected in 22 hVISA strains. The main epidemic clone of hVISA strain in our hospital was ST72-T2431-H3， and they were all from pediatrics. There may be an epidemic of ST72-T2431-H3 hVISA in pediatrics.

Key words Heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus; MLST typing; spa typing;

PFGE typing

金黄色葡萄球菌是一种重要的革兰阳性病原菌，可引起肺炎、脑膜炎和菌血症等多种感染性疾病。据报道，金黄色葡萄球菌的基因型会影响感染的并发症、严重程度和死亡率[1]。目前，关于金黄色葡萄球菌的分子分型方法主要包括脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis， PFGE）、多位点序列分型（mutilocus sequence typing， MLST）、葡萄球菌盒式染色体mec（Staphylococcal Cassette Chromosome mec， SCCmec）分型以及葡萄球菌A蛋白基因（Staphylococcal Protein A， spa）分型等[2]。PFGE分型主要是对细菌的整体DNA进行分析，通过合适的限制性内切酶将DNA切成大小不一的特定片段，利用PFGE技术将这些片段进行分离，根据条带的大小和数量对菌株进行分型[2]。MLST分型是一种主要用于菌株间遗传进化分析的病原菌分型方法[3]，该方法以核苷酸序列为基础，直接对7个管家基因的每个基因座位进行测序，测序产物上传到国际网站上与标准克隆株的序列进行比较，从而鉴定其型别。spa分型是一种根据X区重复序列的数量和序列变异来进行分型的方法，将X区重复序列的聚合酶链反应（polymerase chain reaction， PCR）产物测序结果上传相关网站，从而确定其型别。

近年来，关于异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌（heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus， hVISA）的报道越来越多[4]，但其遗传机制尚不清楚，且不同国家和地区的hVISA菌株的主要流行克隆可能会有较大差异[5]。因此，本研究采用PFGE、MLST和spa分型方法对滨州医学院附属医院hVISA菌株进行分子分型研究，旨在了解本地区hVISA菌株的分子流行病学现状，为临床预防和控制hVISA的传播提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源

收集2019年6月—2019年12月以及2020年7月—2020年8月滨州医学院附属医院鉴定为金黄色葡萄球菌的菌株，排除同一患者的重复标本以及临床资料等缺失的标本后共计263株。所有纳入研究的标本均为合格标本且与临床资料相符。ATCC29213为本科室所留存。MU3及MU50为安徽省立医院检验科戴媛媛老师所赠。

1.1.2 主要试剂

限制性内切酶SmaⅠ和XbaⅠ购自宝生物工程（大连）有限公司；蛋白酶K购自德国Merck公司；TBE缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司；Gelred和溶葡萄球菌酶购自生工生物工程（上海）股份有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、Cel-Red核酸凝胶染料、DNA Maker 1000和PCR试剂均购自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.2 方法

采用回顾性分析方法，从实验室信息系统（laboratory information system，LIS）提取本研究所涉及的263例患者的相关临床资料，并对其临床特征进行调查分析。本研究所涉及内容已通过滨州医学院附属医院科研伦理委员会审批。

1.2.1 痰培养标本的采集与合格标本

标本采集：患者晨起先用漱口液漱口后，再用清水漱口数次，用力咳，待有痰液咳出时立即用无菌痰盒收集，盖上痰盖后及时送检。

合格标本：肉眼观察呈黄色、灰色、铁锈色，浑浊、稠厚、混有团块或血性的标本为合格标本；固定染色后普通显微镜观察，或以相差显微镜直接观察湿片，痰标本中含白细胞、脓细胞和支气管柱状上皮细胞较多，来自颊黏膜的扁平鳞状上皮细胞较少。以白细胞＞25个/低倍镜视野，鳞状上皮细胞＜10个/低倍镜视野，为合格标本。

1.2.2 hVISA菌株的筛选和确认

（1）筛选 hVISA菌株的筛选参考文献[6]并加以改进：分别吸取10 μL浓度为1.5×108 CFU/mL的菌悬液点种在万古霉素浓度为2、3和4 mg/L的脑心浸液琼脂平皿（BHIV2、BHIV3和BHIV4）上。室温晾干后放于37℃温箱培养，24和48 h各观察一次，以48 h后平皿上有≥1个菌落为阳性。ATCC29213为阴性对照，Mu3为hVISA阳性对照，Mu50为万古霉素中介金黄色葡萄球菌（vancomycin-intermediate S. aureus，VISA）阳性对照。

（2）确认 采用菌群分析-曲线下面积（PAP-AUC）法对筛选阳性的菌株进行确认，操作方法和结果判定等参考文献[7]。含浓度分别为0、0.5、1、2、3、4、6和8 mg/L万古霉素的脑心浸液琼脂平皿制备方法参照文献[8]。

1.2.3 DNA的提取与分子分型

（1）DNA的提取 參考试剂说明书提取hVISA菌株的基因组DNA。

（2）PFGE分型 参考金黄色葡萄球菌PFGE操作规程对hVISA菌株进行PFGE分型。使用BioNumerics 5.6软件分析电泳图谱，根据DNA条带的位置和数量，以Dice系数（SD）计算相似值，非加权组平均法（unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）进行聚类分析，条带位置差异容忍度为1.5%，构建系统发育树。SD=[2（nxy）]/（nx+ny），nxy是X菌株和Y菌株共有的条带数，nx是X菌株的条带数量，ny是Y菌株的条带数量。

（3）MLST分型 采用PCR法扩增hVISA菌株的7个管家基因（arcC、aroE、glp、gmk、pta、tpi和yqil），引物设计参考文献[9]，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR扩增条件参照试剂说明书，扩增结束后产物进行琼脂糖凝胶电泳，阳性标本经纯化后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果在www.pubmlst.org上进行比较，确定其ST型别。

（4）spa分型 根据文献[10]设计引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR扩增金黄色葡萄球菌蛋白A重复区域，产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果上传Ridom SpaServer网站，确定其spa型别。

1.2.4 统计方法

数据使用IBM SPSS24.0软件（美国IBM公司）进行统计和分析，计数资料采用χ2检验和Fishers精确检验，P＜0.05时差异有统计学意义。PFGE分型电泳图谱使用BioNumerics 5.6软件（比利时Applid Maths公司）进行分析，应用UPGMA进行聚类分析，Dice相关度分析方法分析相似度系数。

2 结果

2.1 hVISA菌株的筛选及确认结果

263株金黄色葡萄球菌经筛选共得到113株hVISA可疑株，其中BHIV2筛选出108株，BHIV3筛选出24株，BHIV4筛选出5株。113株hVISA可疑株经PAP-AUC法确认后共得到22株hVISA，分离率为8.4%。

2.2 临床特征

22株hVISA菌株对应患者的临床特征见表1。

2.3 hVISA的分子分型结果

2.3.1 PFGE分型结果

聚类分析结果显示22株hVISA菌株的PFGE带型相似值处于62.6%～100%之间（图1）。相似值85%以上的为同一种PFGE型别，22株hVISA共有12种PFGE型别，命名为H1～H12，其中H1型共4株，H3型共6株，H4和H7各2株，其余PFGE型各1株。

2.3.2 MLST和spa分型结果

hVISA的MLST分型共10种，主要为ST72型。spa分型共发现14种，主要为t002、t437以及t2431。hVISA的优势克隆为ST72-t2431和ST59-t437。详细分型结果（表2）。MLST和spa分型电泳图（图2～3）。

3 讨论

金黄色葡萄球菌是社区和医院感染的主要原因，仍然是世界各地的一个主要健康问题[11]。万古霉素作为治疗MRSA感染的首选药物[5]，一直在临床广泛使用，但近年来由于过度使用万古霉素，已经出现了万古霉素不敏感的金黄色葡萄球菌或低水平的万古霉素耐药金黄色葡萄球菌，如VISA和hVISA[12]。研究表明，与万古霉素敏感金黄色葡萄球菌（vancomycin-susceptible S. aureus，VSSA）感染相比，hVISA引起的感染更容易导致治疗失败，并且由于住院时间延长，医疗费用也随之增加[13]。

本研究对滨州医学院附属医院临床分离的263株金黄色葡萄球菌进行筛选，最终得到22株hVISA菌株，分离率为8.4%。本研究中hVISA的分离率低于刘彩林等[14]报道的郑州大学第一附属医院的hVISA分离率（17.9%），稍高于Shen等[15]报道的中国7个地理区域（华东，华南，华北，中南，东北，西北和西南）的hVISA分离率（7.6%）以及程华莉等[16]报道的江南大学附属医院的hVISA分离率（6.4%）。有研究显示，hVISA分离率的不同可能与地域差异、标本量大小以及标本组成等相关，但主要原因是筛选方法不同以及实验室差异较大[17]。本次研究的对象是金黄色葡萄球菌，而其他研究大多为MRSA，这可能也是导致分离率不同的一个因素，本研究结果也显示MRSA组hVISA的分离率高于MSSA组。此外，本研究结果显示不同类型的标本其hVISA的分离率差异具有统计学意义（P＜0.05），因此标本的类型可能也是影响hVISA分离率的一个因素。

本研究hVISA菌株中MLST和spa分型的主要流行克隆为ST72-t2431和ST59-t437，各3株。胡健等[7]的研究中hVISA菌株的MLST和spa分型以ST5-t002为主，其次为ST239-t030；占志平等[18]和刘彩林等[19]的研究结果显示hVISA中MLST和spa分型的主要流行克隆ST239-t030。本次研究中未发现ST239-t030克隆株，与国内hVISA菌株的流行克隆相差较大。尽管本院临床分离的hVISA菌株并不多，但其MLST和spa分型种类却较多，其中MLST分型共10种，主要为ST72型（共5株），其次为ST59和ST25型（各4株）；spa分型共14种，主要为t002、t437以及t2431（各3株）。可见本院hVISA的MLST和spa型别比较分散，并没有特别明显的优势克隆。

本研究对22株hVISA进行PFGE分型和聚类分析，共发现12种PFGE型别，其中主要型别为H3型，其次为H1型。对3种分型联合分析发现，同一MLST和spa型别的菌株其PFGE型别不完全一致，同一PFGE型别的菌株其MLST和spa型别也不完全相同。结合临床资料发现，来源于儿科的6株hVISA菌株中5株均为ST72-H3型，且其中3株的spa分型均为t2431，但分离时间不同，提示在此期间儿科可能存在ST72-t2431-H3型hVISA的流行。同源性分析上看，本院22株hVISA的MLST、spa和PFGE型別都较为分散，且散发的菌株没有明显的优势型别，提示本院hVISA的来源较为广泛。

综上所述，本院22株hVISA菌株的来源较为广泛，共检出10种ST型，14种spa型和12种PFGE型别。本院hVISA的主要流行克隆为ST72-t2431-H3型（共3株），其中MLST和spa分型的主要流行克隆为ST72-t2431和ST59-t437（各3株），PFGE分型的主要型别为H3型（共6株）。儿科可能存在ST72-t2431-H3型hVISA菌株的流行，儿科应该对此予以重视。尽管本次对hVISA的3种分型结果显示hVISA在本院为散发，但还是应该予以重视，防止出现hVISA的暴发。

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收稿日期：2021-12-02

基金项目：山东省自然科学基金资助项目（No. ZR2020MH306和No. ZR2020MH309）；山东省医药卫生科技发展计划基金资助项目（No. 2017WS372）

作者简介：胡远芳，女，生于1994年，硕士，初级检验师，主要研究方向为临床微生物，E-mail： hyf27630929@163.com

通讯作者，E-mail： bingji1218@163.com