市售酶抑制-比色法农残速测试剂盒对多种农药敏感性的研究

乔礼 罗俊霞

酶抑制法农药残留快速检测试剂盒是基于有机磷和氨基甲酸酯类农药对动物体内胆碱酯酶的抑制作用研制的。進行检测时，在胆碱酯酶及其底物（乙酰胆碱）的共存体系中加入农产品样品提取液，当样品中含有不同浓度的有机磷或氨基甲酸酯类农药时，酶活性受到不同程度抑制，乙酰胆碱被酶催化水解的程度发生变化，水解产物与加入的显色剂的变色反应亦随之发生变化；反之，如果试样提取液中未含有该两类农药，酶的活性不被抑制，试样中加入的底物被酶催化水解，其产物与加入的显色剂反应的变色程度较大。目测颜色的变化或用分光光度计测定吸光度在一定时间内的变化值，计算出抑制率，可以粗略判断样品中是否含有该两类农药残留。该方法的核心试剂是酶，而酶来源广泛，不同来源及来源于同一生物体不同部位的酶活性均不相同，对农药的敏感性也存在较大差异，由此衍生出的两种快速检测试剂盒对农药的敏感性也各不相同，因此在日常检测工作中应用该方法的检测结果同样品实际时常不符，出现假阳性或假阴性的结果。为了全面了解市售酶抑制-比色法农药残留快速检测试剂盒的品质，使其在农产品检测与监管工作中发挥更大作用，特安排本试验，以期为使用者提供一定的借鉴作用。

一、 材料与方法

（一） 试验仪器

上海复博农业科技有限公司、上海博纳新技术研究所生产的16通道、CL-BIII型农残速测仪；杰瑞尔电器有限公司生产的SHA-C型、双重恒温水浴振荡器；WH-861型旋涡混合器；北京三二八科学仪器有限公司生产的HH.W21-Cr 420型电热恒温水浴锅；Thermo 品牌的200μL 和Rongtai品牌的 5 mL 移液枪。

（二） 试剂及其配制方法

1.  产自深圳的永道品牌的酶抑制-比色法农药残留快速检测试剂盒；试验用水为纯净水；使用前，采用500 mL的纯净水溶解缓冲盐得到缓冲溶液；使用3 mL的缓冲溶液配制酶和显色剂；使用3 mL的纯净水配制底物。

2. 农药标准品。辛硫磷、喹硫磷、敌敌畏、氧化乐果、毒死蜱、久效磷、三唑磷、杀扑磷、二嗪磷、马拉硫磷、敌百虫、伏杀硫磷、蝇毒磷、水胺硫磷、倍硫磷、甲基异柳磷、丙溴磷、乐果、地虫磷、甲拌磷、甲基对硫磷、对硫磷22种有机磷类农药和涕灭威亚砜、克百威、灭多威、涕灭威、涕灭威砜5种氨基甲酸酯类农药。

农药标准品浓度为1000 mg·L-1，来源于农业环境保护科研检测所，使用时先稀释成80 μg· mL-1的储备液，试验时按照需要进行吸取。

（三）试验设计

试验分别取适量农药标准品于一次性烧杯中，按照2 g称样量，使农药的质量浓度分别为0.05 mg·kg-1、0.5 mg·kg-1、1 mg·kg-1、2 mg·kg-1、3 mg·kg-1，每一种农药设5个浓度梯度；每个浓度水平3次重复。

1.测试方法。对照液和农药测试：对照液和农药的测试方法参照国标进行；设定2.5 mL和3 mL两种样品提取体积。分别移取2.5 mL和3 mL的缓冲溶液和样品提取液于10 mL一次性试管中，再依次加入100μL酶、100μL显色剂，旋涡混匀，在37℃条件下水浴10 min，之后加入100μL底物摇匀，将对照液和样品同时放入16通道的CL-BIII型农残速测仪比色池中进行检测（对照液放第一通道）；仪器根据第一通道测定的对照3 min内吸光度的变化值自动计算得到抑制率，记录抑制率。

2.数据处理。选取5种农药在各浓度水平下3次测定所得抑制率的加权平均值在0～100%的浓度值，用Excel将抑制率和农药浓度常用对数的散点图进行线性拟合，得到浓度-效应曲线方程、求出相关系数及每一种农药对各种试剂盒的半抑制浓度IC50。根据浓度-效应曲线方程y=kx+b求得y=50%时对应的x轴的值，IC50=10 x；线性范围是指抑制率为0对应最大的浓度值到测定的最大的抑制率对应的浓度值之间的范围；同样求出IC10。

因食品安全国家标准中规定新鲜蔬菜中毒死蜱、甲基对硫磷、氧化乐果的最大限量分别为0.05 mg·kg-1、0.02 mg·kg-1、0.02 mg·kg-1，个别试剂盒测定这3种农药的IC50的最大值分别为6.70 mg·kg-1、9.924 mg·kg-1、10.397 mg·kg-1，其对应的IC10的值分别为0.940 mg·kg-1、1.620 mg·kg-1、2.781 mg·kg-1，均大于国家的限量标准，因此，本试验将IC10设定为试剂盒的检测限，以此比较不同的试剂盒对不同农药的敏感性；IC10越低，说明试剂盒对该农药越敏感。当IC10＜10-3 mg·kg-1，试剂盒对农药极敏感；当10-3 mg·kg-1＜IC10＜10-1 mg·kg-1，试剂盒对农药较敏感；当10-1mg·kg-1＜IC10＜1 mg·kg-1，试剂盒对农药不太敏感；当IC10≥1 mg·kg-1，试剂盒对农药不敏感。

通过试验的结果比较2.5 mL和3 mL的样品提取体积对测定结果的影响和该试剂盒对不同的有机磷农药的敏感性。

二、 结果与分析

经过测定，试剂盒测定蝇毒磷和甲基异柳磷，当提取液取用3 mL时，抑制率同农药浓度之间不存在线性关系，当提取液取用2.5 mL时，在农药5个浓度水平下，抑制率均为0。无论样品提取液取用3 mL还是2.5 mL，测定水胺硫磷和倍硫磷，抑制率同农药浓度之间不存在线性关系；伏杀硫磷、丙溴磷、乐果、地虫磷、甲拌磷、甲基对硫磷、对硫磷7种农药，在5个浓度水平下，抑制率均为0。也就是说该试剂盒对蝇毒磷、甲基异柳磷、水胺硫磷、倍硫磷、伏杀硫磷、丙溴磷、乐果、地虫磷、甲拌磷、甲基对硫磷、对硫磷11种农药极不敏感。

（一） 取用3 mL样品提取液试验

由表1知，当提取液取用3 mL时，试剂盒对16种农药的敏感性按照涕灭威亚砜、克百威、灭多威、辛硫磷、涕灭威、喹硫磷、涕灭威砜、敌敌畏、氧化乐果、毒死蜱、久效磷、三唑磷、杀扑磷、二嗪磷、马拉硫磷、敌百虫的顺序依次降低。试剂盒对涕灭威亚砜、克百威农药极为敏感，其IC10均在10-3 mg·kg-1以下，占所测试农药总数的7.41 %；试剂盒对灭多威、辛硫磷、涕灭威、喹硫磷4 种农药较为敏感，其IC10均在10-3～10-1 mg·kg-1，占所测试农药总数的14.81%；试剂盒对涕灭威砜、敌敌畏、氧化乐果3种农药不太敏感，其IC10在10-1～1 mg·kg-1，占所测试农药总数的11.11%；试剂盒对毒死蜱、久效磷、三唑磷、杀扑磷、二嗪磷、马拉硫磷、敌百虫极不敏感，其IC10在1 mg·kg-1以上，占所测试农药总数的25.93%，总体上讲，试剂盒极不敏感的农药占所测试农药的66.67%。

（二） 取用2.5 mL样品提取液试验

由表2可知，当提取液取用2.5 mL时，试剂盒对16种农药的敏感性按照涕灭威亚砜、克百威、灭多威、涕灭威、喹硫磷、涕灭威砜、敌敌畏、辛硫磷、氧化乐果、久效磷、毒死蜱、三唑磷、二嗪磷、伏杀硫磷、马拉硫磷、敌百虫、杀扑磷的顺序依次降低。试剂盒对涕灭威亚砜、克百威农药极为敏感，其IC10均在10-3mg·kg-1以下，占所测试农药总数的7.41 %；试剂盒对灭多威、涕灭威、喹硫磷3 种农药较为敏感，其IC10均在10-3～10-1 mg·kg-1，占所测试农药总数的11.11%；试剂盒对涕灭威砜、敌敌畏、辛硫磷、氧化乐果4种农药不太敏感，其IC10在10-1～1 mg·kg-1，占所测试农药总数的14.81%；试剂盒对久效磷、毒死蜱、三唑磷、二嗪磷、伏杀硫磷、马拉硫磷、敌百虫、杀扑磷极不敏感，其IC10在1 mg·kg-1以上，占所测试农药总数的29.63%，总体上讲，试剂盒极不敏感的农药占所测试农药的66.67%

三、结论与讨论

从IC10 看，在所测试的27种农药中，试剂盒对蝇毒磷、甲基异柳磷、水胺硫磷、倍硫磷、伏杀硫磷、丙溴磷、乐果、地虫磷、甲拌磷、甲基对硫磷、对硫磷11种农药极不敏感，测定时样品提取液无论是取用3 mL还是2.5 mL，在设定的5个农药浓度水平下，抑制率为0或者抑制率同农药浓度之间无线性关系。在用该试剂盒测定实际样品时，当样品中含有这11种农药中的任意一种或者几种（在食品安全国家标準食品中农药最大残留限量中规定的限量以上、在3 mg·kg-1 以下），用该试剂盒测定将出现假阴性；当样品中含有涕灭威亚砜，其含量大于2.041 7×10-4 mg·kg-1、小于食品安全国家标准食品中农药最大残留限量中规定的限量时，用该试剂盒测定将出现假阳性。因此，试剂盒对各农药敏感性的巨大差异是导致试剂盒检测样品出现假阳性和假阴性的原因之一。

根据《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》的规定，采用永道试剂盒进行检测，按照50%的判定阈值进行判定，在所测定的27种农药中，只有当样品中含有涕灭威砜、克百威时可以报出阳性，含有其他25种农药均只能报出阴性，因此，建议国标和行标修改判定阈值。

（责任编辑   程丽红）