不同葡萄品种的耐盐性比较分析

陈丽靓,鲁倩君,马媛媛,刘 迎,赵宝龙,孙军利

(石河子大学农学院/特色果蔬栽培生理与种质资源利用兵团重点实验室,新疆石河子 832000 )

0 引 言

【研究意义】土壤盐渍化影响作物生长[1]。新疆盐碱环境下一些葡萄品种黄化现象严重,喀什哈尔、木纳格、和田红是新疆南疆地区主栽品种,研究新疆南疆不同葡萄品种对NaCl胁迫的生理响应,评价供试葡萄品种的抗盐性,对筛选出耐盐性强的葡萄品种及耐盐葡萄品种资源具有重要意义。【前人研究进展】当土壤中的NaCl浓度达到一定程度时,葡萄光合作用受到抑制,光合效率显著降低[2-5],MDA含量降低[6],体内活性氧大量积累,诱导有关保护酶类表达量增加,如过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等,清除过多的活性氧,减轻其伤害作用,使细胞膜维持稳定,并提高植物的耐盐性[7]。雷成军等[8]研究发现,随着盐分积累和胁迫时间延长,红地球葡萄贝达嫁接苗SOD、POD、CAT活性呈先上升后下降的趋势。砧木间的耐盐性因其自身遗传特性不同存在差异,袁军伟等[9]、牛锐敏等[10]、孙茜[11]、吴梦晓等[12]、马跃[13]、王连君等[14]等在不同葡萄砧木品种的耐盐性鉴定分析中研究结果不一致,供试品种、环境条件和鉴定方法不同,所得结果也不尽相同。【本研究切入点】目前,有关不同砧木或不同葡萄品种耐盐性比较研究较为广泛,但不同品种与砧木进行耐盐性比较的试验较少,需分析与评价不同葡萄品种耐盐性,分析盐胁迫对不同葡萄品种的影响。【拟解决的关键问题】以盆栽不同葡萄品种幼苗为材料,分析100 mmol/L NaCl胁迫对不同葡萄砧木植株盐害指数、光合特性、抗氧化酶含量、丙二醛(MDA)含量的影响,为筛选葡萄抗盐性品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

所用葡萄品种购自山东省志昌葡萄研究所。试验地点位于石河子大学农学院试验站。品种包括5BB、101-14、SO4、3309M、贝达、抗砧3号、喀什哈尔、木纳格、和田红、夏黑,共10种葡萄品种。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

2021年4月将粗细均匀一致、充分成熟的一年生枝条(枝条长度15～20 cm,含3～5个饱满芽),分别移栽于18×18(cm)的营养钵内,基质配方为沙子∶蛭石∶草坪土=2∶2∶1[8],于石河子大学试验站进行露天苗木培育。待幼苗长到6～8片真叶时,开始进行100 mmol/L NaCl盐溶液处理[10]。

共设置2个处理:(1)对照(CK):浇灌清水;(2)NaCl处理(T):浇灌100 mmol/L NaCl。5 d浇灌1次,每次在19:00～20:00时浇灌,用量600 mL。每个处理5盆,重复3次。在盐胁迫处理后第15 d分别选取叶部位新梢顶部以下第3～5片功能叶片测定其生理指标。

1.2.2 测定指标

1.2.2.1 盐害指数

NaCl处理的第15 d调查对葡萄叶片的受害情况,观察受害表现,计算盐害指数(SI),盐害分级参照刘崇怀等[15]标准。

盐害分为以下5个级别:

0级:无盐危害症状;

l级:有少部分叶尖、叶缘或叶脉变黄;

2级:约1/2的叶尖、叶缘焦枯;

3级:大部分叶片有叶尖、叶缘焦枯和落叶现象;

4级:枝枯、叶落、直至死亡。

盐害指数(SI)=(1×S1+2×S2+3×S3+4×S4)/(4×总株数)×100%。

式中,S为相应盐害级的株数。

1.2.2.2 光合气体交换参数

NaCl处理第5 d选取植株叶部位新梢顶部以下第3片功能叶,采用LI-6400XT便携式光合仪(美国LI-COR公司生产)测定交换参数:气孔导度(Gs)、净光合速率(Pn)、胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)等。

1.2.2.3 丙二醛(MDA)含量

NaCl处理第15 d选取叶部位新梢顶部以下第3～5片功能叶,采用TBA法[16]测定MDA含量。称取叶片各1 g,加入少量石英砂和10%三氯乙酸2 mL,研磨至匀浆,再加8 mL 10%三氯乙酸进一步研磨,以4 000 r/min离心10 min匀浆,其上清液为丙二醛提取液。取2支干净试管编号,各加入提取液2 mL,对照管加蒸馏水2 mL,各管再加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液。摇匀,混合液在沸水浴中反应15 min,迅速冷却后再离心。取上清液分别在532、600和450 nm波长下测定吸光度(A)值。

MDA浓度C(μmol/L)=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450.

MDA含量(μmol/g FW)=C×V/W.

式中,V为提取液体积,W为样品鲜重。

1.2.2.4 抗氧化酶活性

(1)CAT活性

过氧化氢酶(CAT)活性采用过氧化氢酶法测定[16]。取酶粗提取液50 μL于比色皿中,加入3 mL酶活性测定反应液(包括2.0 mL 50 mmol/L pH 7.0的PBS,1.0 mL 0.067 mol/L的H2O2),用50μL 50 mmol/L pH 7.8的PBS代替酶液作为空白,立即用紫外分光光度计测定240 nm下的吸光度值并计时,每隔1 min读1次值。以1 min内A240减少0.1酶量表示1个酶活单位U,计算CAT活性(U/(min·g))。

CAT活性(U/(min·g))=(A240×V1)/(0.1×V2×t×W).

式中,A240:为单位反应时间内吸光值的变化;V1: 提取酶液总体积(mL);V2:测定时取用酶液体积(mL);t: 反应时间(min);W:样品鲜重(g)。

(2)POD活性

POD活性采用愈创木酚法[17]测定。取酶粗提取液50 μL于比色皿中,加入3 mL酶活性测定反应液(包括50 mmol/L pH 7.8的PBS,1.0 mL 0.6%的H2O2,1.0 mL 0.05 mol/L的愈创木酚),以50 μL 50 mmol/L pH 7.8的PBS代替酶液作为空白,立即用分光光度计测定470 nm下的吸光度值并计时,每隔1 min读1次值(读0、1、2 min的吸光度值)。以1 min内A470的增加表示1个过氧化物酶活性单位U,计算POD活性(U/(min·g))。

POD活性(U/(min·g)) =(A470×V1)/(0.01×V2×t×W).

式中,A470:单位反应时间内吸光值的变化;V1: 提取酶液总体积(mL);0.01:1 min增加0.01为一个酶活单位;V2:测定时取用酶液体积(mL);t: 反应时间(min);W:样品鲜重(g)。

(3)SOD活性

SOD活性采用氮蓝四唑(NBT)法[18]测定。取酶粗提取液50 μL,依次加入1.5 mL 50 mmol/L的PBS(pH 7.8);0.3 mL 130 mmol/L的蛋氨酸;0.3 mL 750 μmol/L的NBT;0.3 mL 100 μmol/L的EDTA-Na2;0.3 mL 20 μmo/L的核黄素;0.25 mL蒸馏水。以不加入酶液(用缓冲液代替)的试管为最大光化还原管,将各管置于4 000 lx光照培养箱或日光灯下照光约20 min,用黑布遮光终止反应。用PBS(pH7.8)调零,用分光光度计测定560 nm下的吸光度值。以1 min内抑制光化还原50% NBT表示1个酶活性单位U,计算SOD活性(U/g)。

SOD活性(U/g)=(A光照-A560)×V1)/0.5×A光照×V2×W.

式中,A光照:光照管的吸光度值;A560:560 nm的吸光度值;V1酶提取液总体积(mL);0.5:抑制NBT 光化还原50%为1个酶活;V2: 测定时取用酶液体积(mL);W:样品鲜重(g)。

1.3 数据处理

使用SPSS26分析数据,Microsoft Excel 绘制表格以及主成分分析。

2 结果与分析

2.1 NaCl 胁迫下不同葡萄品种盐害指数比较

研究表明,100 mmol/L NaCl胁迫15 d,10个葡萄品种均出现不同程度的盐害症状,和田红、木纳格、喀什哈儿、夏黑盐害指数较低,分别为23.0%、25.0%、26.0%、30.0%;101-14、抗砧3号、贝达盐害指数较高,分别为48.0%、50.0%、53.0%;而3309M、5BB、SO4盐害指数最高,分别为63.0%、65.0%、70.0%。表1

2.2 NaCl胁迫下不同葡萄品种光合参数变化

研究表明,100 mmol/L NaCl处理5 d后降低了各葡萄品种叶片的净光合速率(Pn),其中和田红、木纳格、夏黑和喀什哈尔降低幅度较小,盐处理至5 d分别比各对照降低了31.84%、43.06%、47.28%和39.47%;101-14、抗砧3号和贝达较各对照相比降幅较为显著,分别降低了56.00%、60.31%和64.08%;SO4、5BB和3309M降低幅度较大,分别比各对照显著降低了72.15%、72.07%和68.16%。表2

NaCl胁迫下各葡萄品种气孔导度(Gs)呈不同程度的降低趋势,100 mmol/L NaCl胁迫至5 d时,和田红、木纳格、夏黑和喀什哈尔气孔导度(Gs)降低幅度较小,分别比各对照降低了27.13%、48.84%、43.01%和61.44%;101-14、抗砧3号和贝达较各对照相比降幅达显著性水平,分别降低了90.49%、101.32%和107.97%;SO4、5BB和3309M较各对照相比达显著性水平,分别比各对照显著降低了186.85%、161.87%和214.10%。

表1 盐胁迫后15 d不同葡萄品种盐害指数比较

NaCl胁迫下各葡萄品种胞间CO2浓度(Ci)呈不同程度的升高趋势,和田红、木纳格、夏黑和喀什哈尔胞间CO2浓度与各对照相比没有显著性差异;101-14、抗砧3号和贝达较各对照相比增幅达显著性水平,分别显著上升了20.50%、27.95%和21.09%;SO4、5BB和3309M较各对照相比达显著性水平,分别比各对照显著上升了35.29%、32.26%和30.14%。

NaCl胁迫下各葡萄品种蒸腾速率(Tr)呈不同程度的降低趋势,和田红、木纳格、夏黑和喀什哈尔蒸腾速率(Tr)降低幅度较小,分别比各对照降低了27.35%、27.95%、50.69%和53.08%;101-14、抗3和贝达较各对照相比降幅达显著性水平,分别降低了109.53%、126.66%和104.27%;SO4、5BB和3309M较各对照相比达显著性水平,分别比各对照显著降低了265.47%、170.88%和169.44%。表2

表2 NaCl胁迫5 d下不同葡萄品种光合参数变化

2.3 NaCl胁迫下不同葡萄品种叶片抗氧化酶含量的变化

研究表明,100 mmol/L NaCl胁迫处理导致不同葡萄叶片抗氧化酶活性呈现不同程度的升高,其中和田红、木纳格、夏黑和喀什哈尔叶片的CAT酶活性较各对照相比达显著性水平,分别显著上升了49.08%、58.70%、44.60和50.39%;而5BB、3309M和SO4叶片的CAT酶活性较各对照相比,分别上升了27.86%、26.74%和36.96%;抗砧3号、101-14和贝达叶片的CAT酶活性较各对照相比达较显著性水平,分别较各对照增加了37.28%、32.84%和36.62%。

100 mmol/L NaCl胁迫处理导致不同葡萄叶片POD含量呈现不同程度的升高,和田红、木纳格、夏黑和喀什哈尔叶片的POD酶活性分别较各对照相比显著上升了44.21%、46.64%、68.06和58.81%,呈现显著性差异变化;而5BB、3309M和SO4叶片的POD酶活性较各对照相比,分别上升了27.93%、22.66%和25.84%;抗砧3号、101-14和贝达叶片的POD酶活性较各对照相比达较显著性水平,分别较各对照增加了39.45%、31.45%和31.84%。

100 mmol/L NaCl胁迫处理导致不同葡萄叶片SOD含量呈现不同程度的升高,和田红、木纳格、夏黑和喀什哈尔叶片的SOD酶活性分别较各对照相比显著上升了56.63%、45.81%、43.23%和43.23%;而5BB3309M和SO4叶片的SOD酶活性较各对照相比,分别上升了21.86%、28.71%和25.27%;抗砧3号、101-14和贝达叶片的SOD酶活性较各对照相比达较显著性水平,分别较各对照增加了38.29%、37.40%和32.36%。图1

图1 不同葡萄品种叶片CAT、POD、SOD含量变化

2.4 NaCl胁迫下不同葡萄品种叶片MDA含量的变化

研究表明,100 mmol/L NaCl胁迫处理导致不同葡萄叶片MDA含量呈现不同程度的升高,以和田红、木纳格、夏黑和喀什哈尔的升高幅度最小,与各对照相比没有显著性差异,而5BB、3309M和SO4叶片的MDA含量较各对照相比,分别显著上升了41.71%、49.96%和57.10%;抗3、101-14和贝达的升高幅度与各对照相比有较显著性差异,MDA含量分别上升了34.03%、36.51%和32.79%。图2

图2 不同葡萄品种叶片MDA含量变化

2.5 不同葡萄品种耐盐性评价

研究表明,提取特征值>1的2个主成分,特征值分别为5.866、1.152,累计方差贡献率为73.324%、87.722,具有较强信息代表性,达到分析要求。第一主成分在SOD、CAT、GS、POD、Tr上有较高的荷载量,第二主成分在CAT、GS、Ci、Tr、Pn上有较高的荷载量。表3

前2个主成分的累计贡献率达87.72%,选取前2个主成分作为抗盐性分析的依据,各综合指标的对应特征向量为:

表3 主成分分析成分荷载矩阵

第1主成分:

Y1=0.400X1-0.885X2+0.391X3+0.384X4-0.380X5+0.373X6+0.319X7-0.012 4X8.

第2主成分:

Y2=-0.188X1-0.043 8X2+0.104X3+0.358X4-0.354X5+0.348X6+0.297X7-0.011X8.

式中,Y代表主成分,X1,2,3....代表各项成分值;

在第1主成分的表达式中,第1、3、4、6、7项的系数比较大,分别代表SOD、CAT、Gs、POD、Tr;在第2主成分的表达式中,第3、4、6、7项的系数比较大,分别代表CAT、Gs、POD、Tr。

综合得分(F)是每个主成分得分与对应贡献率乘积之和,各品种在盐胁迫下的排名为和田红、木纳格、喀什哈尔、夏黑、101-14、抗砧3号、贝达、5BB 、SO4、3309 M。表4

表4 10个葡萄品种主成分值及排序

3 讨 论

葡萄具有较强的耐盐性,但不同品种之间的耐盐性存在差异,选用优良的抗性砧木,可以明显提高接穗品种的抗盐性,在抵御逆境、病虫等方面发挥重要作用[9]。逆境胁迫下,植物盐害指数与耐盐率呈负相关[19]。研究表明,和田红、木纳格、夏黑和喀什哈尔盐害指数最低,为耐盐品种;抗砧3号、101-14和贝达盐害指数较低,为较耐盐类型;5BB、3309 M和SO4盐害指数最高,为对盐敏感类型。袁军伟等[9]在21份葡萄砧木品种资源耐盐性鉴定试验中表明,101-14为耐盐类型,贝达为对盐较敏感类型;牛锐敏等[10]在研究盐胁迫对不同品种葡萄砧木生长影响的试验中发现101-14为耐盐类型,5BB、1103P耐盐性中等,贝达、140R耐盐性弱。同一葡萄砧木品种在不同试验中的耐盐性也不相同[20-21]。

在NaCl胁迫下,葡萄砧木常表现为光合速率降低、气孔阻力升高[3],体内的活性氧大量积累,诱导有关保护酶类表达量增加[22],且耐盐性弱的葡萄砧木MDA含量显著高于耐盐性强的葡萄砧木[23]。试验研究发现,与各对照相比和田红、木纳格、夏黑和喀什哈尔叶片的Pn、Gs、Tr降低幅度最小,Ci和MDA含量上升幅度最小;101-14、抗砧3号和贝达叶片的Pn、Gs、Tr、Ci和MDA含量变化幅度较为显著;SO4、5BB和3309 M叶片的Pn、Gs、Tr降低幅度最大,Ci和MDA含量上升幅度最大,与付晴晴等[22]在研究不同杂交砧木的耐盐性试验中发现,耐盐性强的A34砧木叶片的Pn、Gs、Tr含量均高于耐盐性弱的B26砧木,而Ci含量相反的结果一致。NaCl胁迫下气孔限制是导致葡萄净光合速率降低的主要原因之一,而Ci上升,在这时期,非气孔限制占了主导因素,可能是由于随着NaCl胁迫加重,叶肉细胞受到损伤,叶绿体结构破坏等原因造成的[24]。葡萄耐盐光合生理特性较复杂,可能与品种耐盐性、气孔限制、叶绿体结构破坏、光合电子传递、碳同化关键酶Rubisco活性、RuBP 再生能力等有关[25]。

郝玉杰等[26]在NaCl胁迫对2个葡萄品种生长及生理特性的影响试验中发现,耐盐性强的非洲黑玉只在NaCI浓度为4 g/L时的各项生理指标与对照存在显著性差异,而耐盐性弱火洲红玉则在各NaCl浓度处理下的各项生理指标均与对照存在显著性差异。葡萄的抗盐能力与保护酶活性的大小是密切相关的[27-30]。

4 结 论

在NaCl胁迫下,与各对照相比,和田红、木纳格、喀什哈尔和夏黑四种葡萄的SOD、POD、CAT活性的增幅最大,而5BB、3309 M和SO4的SOD、POD、CAT活性的增幅最低;抗砧3号、101-14和贝达的SOD、POD、CAT活性的增幅较低,和田红、木纳格、喀什哈尔和夏黑为耐盐品种;抗砧3号、101-14和贝达为中等耐盐品种,5BB、3309 M和SO4为不耐盐品种。