五味子挥发油改善皮肤老化作用研究①

韩鑫垚, 王金鑫, 张欣梦, 闫森博, 王 磊, 陈雨欣, 袁 敏

(佳木斯大学药学院,黑龙江 佳木斯 154007)

0 引 言

全球老龄化形势愈发严峻,使得人们对于提升生活品质和追求美感的愿景更加迫切,全民“抗氧化”、“抗衰老”时代正在到来。为迎合这一需求,市场上抗衰老护肤品的种类日益繁多,而受众在关注产品功效性的同时,开始考虑成分的安全性。天然草本植物提取物因毒副作用小、温和、生物相容性好等优势颇受消费者喜爱,使得研究者将开发抗衰老添加剂的目光集中在天然植物提取物上[1]。

五味子,为木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果实,是可用于保健食品的中药。五味子果实中富含多种有效成分物质,如木脂素类、多糖、挥发油等,在疾病治疗方面具有广泛的应用前景[2]。五味子挥发油是从五味子的藤茎、叶、果实和种子中提取出的具有挥发性油状液体芳香混合物,主要以为萜类成分为主,具有镇咳、消除疲劳、抵抗衰老等功效[3]。近年来,五味子挥发油因优越的天然抗氧化性、生物相容性和安全等优势,使其成为潜在的功能性化妆品添加剂,这为满足人们精神生活和附加产值资源化利用方面提供研究活力。

将五味子果实粉碎,采用水蒸气蒸馏法收集挥发油,测定其DPPH·清除率,对透明质酸酶、胶原蛋白酶和弹性蛋白酶的抑制率,分析其在抵抗皮肤衰老过程中发挥的重要作用。

1 实 验

1.1 试剂与仪器

试剂:1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·,上海麦克林公司);抗坏血酸(Vc, 上海麦克林公司);下述试剂均来自天津大茂化学试剂厂:甲醇;磷酸二氢钠;磷酸氢二钠;下述试剂均来自美国Sigma 公司:弹性蛋白酶;胶原蛋白酶;N-(3-[2-呋喃基]丙烯酰)-亮氨酰-甘氨酰-脯氨酰-丙氨酸(FALGPA);牛血清白蛋白(BSA);没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG);N-琥珀酰基-三-丙氨酸-对硝基苯胺(SANA);透明质酸酶;透明质酸。

仪器:FC型酶标仪(赛默飞世尔仪器有限公司);超声清洗仪(上海豫明仪器有限公司);79-1磁力加热搅拌器(山东邺城华鲁电热仪器有限公司);电热鼓风干燥箱(南京仪器厂)。

1.2 五味子挥发油的提取

取100 g干燥的五味子果实经粉碎机打碎成粉末状,量取 1500 mL蒸馏水,置于圆底烧瓶中。浸泡1h后,连接蒸馏装置,启动加热套,使得混合液保持微沸状态,注意观测提取器中的液面状态和高度。当提取时间达到3.5 h后,关闭加热装置。提取器中油水两相分层,上层油相接入挥发油瓶。使用无水硫酸钠去除水分,混合物离心后吸取上层液体即为五味子挥发油。

挥发油产率 =m1/m

式中:m1为五味子挥发油质量g;m为五味子粗粉质量g。

1.3 DPPH·清除实验

根据Manzocco等人的实验操作方法,加以改进[4]。在96孔板中依次加入100μL不同浓度的五味子挥发油,100μL DPPH·试剂(0.2mmol/L),混合均匀,25℃ 静置避光30 min后,再次混合均匀于酶标仪下518nm测吸光度值。Vc作为阳性对照,每个样品重复三次。按如下公式计算DPPH·清除率:

清除率(%)=(Ai-Aj/A0)×100%

式中:Ai为样品混合溶液的吸光度值;Aj为样品与甲醇混合溶液的吸光度值;A0为甲醇与DPPH·的混合溶液的吸光度值。

1.4 抑制透明质酸酶活性实验

在Kass等人的实验方法的基础上加以改进[5]。在96孔板中,分别加入50 μL五味子挥发油的乙醇溶液与50 μL透明质酸酶溶液(4～10U/mL),再加入 12 μL磷酸缓冲液(0.3mol/L,pH=5.35),50 μL透明质酸钠溶液(0.3 mg/mL),震荡混匀,37℃孵育45 min,加入100 μL酸性白蛋白溶液(含0.1%BSA)。震荡混匀后在600nm波长处用酶标仪测定吸光度。

1.5 抑制胶原蛋白酶活性实验

依据Widowati等人建立的实验方法,在此基础上加以修改[6]。在96孔板中,依次加入50 μL五味子挥发油的乙醇溶液、胶原蛋白酶溶液(3 mg/mL)和Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L,pH=7.5),震荡混匀后,37℃孵育15 min,加入50 μL FALGPA (0.48mg/mL)溶液。37℃反应20min,于345nm处测定吸光度。

1.6 抑制弹性蛋白酶活性实验

参考Mathen等人建立的实验方法[7]。在96孔板中,分别加入50 μL五味子挥发油的乙醇溶液、弹性蛋白酶溶液(0.5 U/mL)和Tris-HCl缓冲液(0.1mol/L,pH=8),震荡混匀,在37℃预孵育15 min;加入50 μL SANA(1 mmol/L),37℃孵育20 min,震荡混匀后在410 nm处测定吸光度。

以上抑制酶实验均以EGCG为阳性对照,所有样品重复三次。

上述酶的抑制率根据如下公式进行计算:

抑制率(%)=(1-A空白/A样品)×100%

式中:A样品为全部物质混合后溶液的吸光度;A空白为不加样品剩余物质混合后溶液的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 五味子挥发油的DPPH·清除效果

Vc是公认的、应用较为广泛的抗氧化活性物质,因此选用Vc作为阳性对照,来评价五味子挥发油的抗氧化能力。五味子挥发油和Vc对DPPH·的清除效果如图1所示,随着浓度的增大,DPPH·清除能力增强,呈正相关。当挥发油浓度达到6.25%以上时,DPPH·的清除效果趋于平稳;浓度为25%时,清除率最大为67.81%。总体来看,五味子挥发油具有良好的DPPH·清除能力,但略低于阳性对照Vc。五味子挥发油中主要成分为萜烯类化合物,它们具有抗氧化性、抗病毒及镇痛活性[8],由此推测其在DPPH·清除过程中能发挥重要的作用。

图1 五味子挥发油对DPPH·的清除活性

2.2 五味子挥发油抑制透明质酸酶活性分析

生物体衰老是生命进程中必经的环节,皮肤衰老尤为明显。皮肤分为表皮,真皮和皮下组织。细胞外基质(ECM)是皮肤最外层,由成纤维细胞和蛋白质组成,其中蛋白质包括胶原蛋白和弹性蛋白[9]。ECM的降解与涉及皮肤衰老相关酶的活性密切相关,这些酶包括透明质酸酶、弹性蛋白酶和胶原蛋白酶。

透明质酸酶能够降解面部透明质酸水平,透明质酸对皮肤起到避免水分流失、参与ECM生成的作用,因此,有效抑制透明质酸酶活性至关重要。选用“天然的人体保鲜剂”EGCG作为阳性对照,评价五味子挥发油的皮肤抗衰老活性。由图2可知随着浓度增大,五味子挥发油和EGCG对透明质酸酶的抑制作用不断增强。在浓度为0.75 mg/mL时,挥发油和EGCG对透明质酸酶的抑制率相当,分别为80.83%和81.15%。其余浓度下,挥发油对透明质酸酶的抑制率甚至大于EGCG。为了更直观地比较两者对酶的抑制效果,用SPSS 16计算得到它们的IC50值,IC50值越小,对酶活性的抑制能力越强。表 1中显示IC50(五味子挥发油,184.586±5.218μg/mL)

图2 五味子挥发油对透明质酸酶的抑制作用

2.3 五味子挥发油抑制胶原蛋白酶活性分析

胶原蛋白酶能够降解面部胶原蛋白水平,胶原蛋白加快皮肤细胞的新陈代谢速度,修复断裂、老化的弹力纤维。五味子挥发油和EGCG对胶原蛋白酶的抑制作用如图3所示。在0 ～ 2 mg/mL浓度范围内,挥发油的抑制活性均小于EGCG,且挥发油的最大抑制率为68.98%,EGCG为81.26%。表1中IC50(五味子挥发油,366.425±5.904μg/mL)> IC50(EGCG,265.482±5.582μg/mL)。当浓度小于1mg/mL时,挥发油和EGCG对胶原蛋白酶的抑制活性相当,浓度继续增大,挥发油的抑制率增长趋于平稳,变化区间在66.10%-68.98%之间,说明低剂量的五味子挥发油可实现较大程度的抑制效果,有效保证面部胶原蛋白水平,使肌肤紧致富有光泽。

图3 五味子挥发油对胶原蛋白酶的抑制作用

图4 五味子挥发油对弹性蛋白酶的抑制作用

2.4 五味子挥发油抑制弹性蛋白酶活性分析

弹性蛋白酶能够降解面部弹性蛋白水平,弹性蛋白负责皮肤的弹性和强度,保持皮肤的柔韧性。五味子挥发油和EGCG对弹性蛋白酶的抑制作用如图4所示。随着浓度的增大,两者的抑制率均显示为增长趋势。当浓度为0.75 mg/mL,挥发油的抑制率增长趋于平缓,变化区间为91.79%-96.34%,而EGCG的抑制率依增长幅度略大于挥发油。与EGCG相比,挥发油对弹性蛋白酶抑制作用明显较大,挥发油的最大抑制率可达96.34%,EGCG为75.39%,表1中IC50(五味子挥发油,103.710±4.642μg/mL)

表1 五味子挥发油和EGCG抑制酶活性的IC50值

3 结 论

采用水蒸气蒸馏法提取五味子挥发油,并研究了其DPPH·清除能力和与皮肤衰老相关酶的抑制作用。结果表明五味子挥发油具有一定DPPH·清除能力和抑制胶原蛋白酶的作用。重要的是,其表现出显著的透明质酸酶和弹性蛋白酶的抑制作用,甚至强于EGCG,这表示五味子挥发油在改善皮肤老化现象有潜在研究价值。五味子作为原料,来源广泛且价格低廉,再加上提取方法简单,将来有望在化妆品和保健品领域投入使用。