安庆六白猪Nramp1基因多态性研究

付鑫琳 朱杰 郭江 文利新 谭国华 刘杨 马海明

摘  要：为探讨抗病力相关基因天然抗性相关巨噬蛋白1（natural resistance associated macrophage protein 1，Nramp1）在安庆六白猪上的遗传多态性，本研究利用PCR-RFLP检测该基因HinfⅠ位点的多态性；结果表明：安庆六白猪Nramp1基因A/B位点的A基因和B基因频率分别为0.40和0.60，这表明安庆六白猪Nramp1基因的B等位基因为优势等位基因。本研究为安庆六白猪抗病力性状的深入研究打下了基础。

关键词：猪；Nramp1基因；抗病力性状；安庆六白猪

天然抗性相关巨噬蛋白1（natural resistance associated macrophage protein 1，Nramp1）对巨噬细胞的抗菌活性有调节作用，同时能抑制多种胞内病原体，如牛结核分枝杆菌、沙门菌和利什曼原虫等的侵染和易感[1]。动物的Nramp1基因主要在吞噬细胞，如巨噬细胞和多形核白细胞及外周血细胞中特异性表达[2]，可提高动物机体的固有免疫力，影响宿主对多种胞内寄生病原微生物的早期免疫反应，而且对多种传染性疾病和自身免疫性疾病的抗性具有非特异性[3]，在猪选种育种过程中是提高综合抗病力性状的分子遗传标记位点之一[4]。安庆六白猪具有抗病力强的特性，属于肉脂兼用型地方猪种。本研究利用PCR-RFLP对安庆六白猪Nramp1基因的HinfⅠ位点进行多态性分析，以期为安庆六白猪抗病力性状的深入研究打下基础。

1  材料与方法

1.1 试验样本

应用随机抽样法，采集108个安庆六白猪耳组织样本。

1.2 PCR-RFLP引物设计

根据发表在GenBank数据库中的猪Nramp1基因全长序列，通过Primer premier 5.0软件设计安庆六白猪通用引物，上游引物为5-TCT CCA CAT CCT CTG TGG CAA-3，下游引物为5-ATG GAG AGT GGT AAC TGC CGT-3，扩增目的片段的长度为504 bp，引物由北京三博生物工程有限公司合成。

1.3 PCR扩增

使用特异性引物对样本DNA进行PCR扩增。25 μL PCR反应体系：ddH2O 17 μL，基因组DNA 1 μL，上下游引物（10 μmol/μL）各0.5 μL，dNTP（10 mmol/L） 2 μL，10×buffer 2.5 μL，Tap DNA聚合酶 1 μL，MgCl2 0.5 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环30次；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.4 PCR产物酶切反应

20 μL酶切反应体系：PCR反应产物     5 μL，内切酶HinfⅠ 0.7 μL，10×酶切缓冲液2.0 μL，加ddH2O补足。37 ℃水浴反应16 h，用核酸染料染色的2.0％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定，凝胶成像系统观察成像，根据限制性酶切图谱中的特征条带确定并记录每份样本的基因型。

2  结果与分析

用2％琼脂糖凝胶电泳对所获得的PCR扩增产物进行检测，获得的产物与目标片段大小一致，并且产物条带稳定性和特异性较高，清晰，无杂带，可直接用于酶切分析。

当存在酶切位点时，内切酶HinfⅠ可特异性地将504 bp片段切为332 bp和172 bp两个片段。将酶切产物通过2％的琼脂糖凝胶电泳检测分型，共检测出AA基因型（504 bp），BB基因型（332 bp、172 bp）和AB基因型（504 bp、332 bp、172 bp）（图1）。

安庆六白猪Nramp1基因的基因型频率及等位基因频率见表1。从表1可知，B等位基因为优势等位基因，有望作为遗传标记。

3  讨论

畜禽抗病力性状是一个既受数量基因调控，又受环境因素影响的复杂的阈性状，由于其表型的遗传规律不服从孟德尔遗传定律，且呈非连续性变异，利用常规的表型选择来获得理想的改良进展比较困难。因此，利用分子遗传标记辅助育种，可以有效促进畜禽抗病力性状的固定[5]。本研究通过对安庆六白猪Nramp1基因多态性的分析，发现B基因为优势等位基因，有可能作为影响畜禽抗病力性状的候选基因标记位点，为猪的抗病力性状选育积累了有益的资料。

参考文献

[1] CELLIER M， GOVONI G，VIDAL S，et al．Human natural resistance-associated macrophage protein： cDNA cloning， chromosomal mapping， genomic organization， and tissue-specific expression[J]．Journal of Experimental Medicine，1994，180（5）：1741-1752.

[2] 张斌，韩敏，相德才，等．滇陆猪Nramp1基因多态性对其在组织中表达的影响[J]．南方农业学报，2020，51（1）：202-208.

[3] 相德才，张斌，刘邵娜，等．迪庆藏猪Nramp1基因第二内含子和第二外显子多态性位点遗传分析[J]．养猪，2020（2）：60-62.

[4] SUN H S，WANG L，ROTHSCHILD M F，et al．Mapping of the natural resistance-associated macrophage protein 1 （NRAMP1） gene to pig chromosome 15[J]．Animal Genetics，1998，29（2）：138-140.

[5] 付保強，彭帅，顾亚荣，等．猪Nramp1基因内含子6的SNP多态性分析[J]．现代畜牧兽医，2018（10）：21-24.