天津水稻穗腐病病原菌鉴定及室内毒力测定

姚玉荣　霍建飞　贵海燕　郝永娟　杨秀荣　孙淑琴　王万立

关键词：水稻穗腐病：分离鉴定：稻黑孢霉：毒力测定

中图分类号：S435.11 文獻标识号：A 文章编号：1001-4942（2023）03-0148-05

近些年，天津市大力发展小站稻的种植，天津市农委编制出台了《天津小站稻振兴规划方案》，提出到2020年天津市小站稻种植面积稳定在5.33万公顷，2022年达到6.67万公顷。随着水稻种植面积的增大，病害发生种类和危害程度日益严重，水稻穗腐病对水稻产量和品质有较大影响，主要症状为在水稻颍壳上形成褐色斑点。该病在我国主要稻区均有发生。黄世文等报道的引起杭州水稻穗腐病病原菌主要为细交链格孢菌（Alternaria tenuis）、层出镰刀菌（Fusarium， prolif-eratum，）、新月弯孢菌（Curvularia lunata）及澳大利亚平脐孺孢菌（Bipolaris australiensis）。费丹等报道安徽省水稻穗腐病的病原菌主要有层出镰刀菌（F.proliferatum）、细交链格孢菌（A.tenuis）、新月弯孢菌（C.lunata）、稻黑孢霉（Nigrosporaoryzae）。胡颂平等研究发现引起江西地区水稻穗腐病的主要病原菌为厚垣镰刀菌（F.chlamydosporum）和细极链格孢（A.tenuissima），香茅弯孢菌（C.cymbopogonis）和稻黑孢霉（N.oryzae）两种病原菌也有发生，且病原菌种类分布具有明显的区域性。马盾等报道了新疆水稻穗腐病病原菌主要为层出镰刀菌（F.prolifera-tum），其次为新月弯孢菌（C.lunata）和细交链格孢菌（A.tenuis）；在水稻抽穗前5～7天采用50%咪鲜·稻瘟灵可湿性粉剂稀释1500倍液、25%咪酰胺乳油稀释1600倍进行喷雾，能够有效预防该病害的发生。2016—2018年陈利军等明确了河南信阳水稻穗腐病的病原菌种类主要为镰孢菌（Fusarium， spp.）、细极链格孢（A.tenuissi-ma）、球黑孢菌（N.sphaerica）、稻黑孢霉（N.oryzae）、棒弯孢（C.clavata）、新月弯孢（C.luna-ta）、稻平脐蠕孢（Bipolaris oryzae）和草酸青霉（Penicillium， oxalicum）。由于不同地区水稻穗腐病病原菌不同，使得该病害防治十分困难。

本研究对天津水稻主产区穗腐病病原菌进行分离，采用形态学和分子生物学方法对其进行鉴定，并对病原菌的药剂敏感性进行测定，以期为研究该病原菌的致病机理、病害流行规律奠定基础，并为该病害的科学防治提供依据。

1材料与方法

1.1试验材料

2020、2021年连续两年对天津市宝坻区八门城村水稻种植田水稻穗腐病病样进行采集，田间症状表现为水稻颍壳出现褐色斑点，发病严重时谷粒干瘪、结实率降低、稻米畸形。

1.2病原菌的分离与纯化

采用常规组织分离法：将新鲜、发病的水稻穗冲洗干净，剪取穗颍壳上病健交界处5 mm节段，用75%乙醇消毒30 s，无菌水清洗3次，无菌滤纸吸干水分后用镊子置于含有0.1 g/L氨苄青霉素的PDA培养平板上，放人28℃培养箱培养3～4d，待长出菌丝后进行单孢纯化，保存备用。

1.3病原菌分子鉴定

将病原菌接种到PDA培养基中，置于25℃恒温培养箱中培养。收集菌丝用CTAB法提取总DNA。用真菌ITS序列通用引物ITS1和ITS4（ITSl：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行PCR扩增。PCR扩增体系：2×Es Taq Master Mix（ Dye）25μL，上下游引物各2μL，DNA模板2μL，ddH₂O19μL。扩增程序：94℃4 min;94℃ 30 s，58℃30s，72℃ 50 s，共30个循环；72℃ 10 min。PCR扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后送天津金唯智生物科技有限公司测序。测序结果进行同源性分析。

1.4病原菌室内毒力测定

供试药剂：95.2%苯醚甲环唑，宁波三江益农化学有限公司：97%戊唑醇，江苏剑牌农药化工有限公司：95.3%丙环唑，天津市华宇农药有限公司；95.1%嘧菌酯，利民化工股份有限公司；98%吡唑醚菌酯，陕西美邦农药有限公司；95%咯菌腈，北京燕化永乐农药有限公司：93.4%噻呋酰胺，吉林省八达农药有限公司；80%代森锰锌可湿性粉剂，先正达（苏州）作物保护有限公司；75%三环唑可湿性粉剂，江苏耘农化工有限公司。

病原菌室内毒力测定采用菌丝生长速率法。配制系列梯度浓度（100、10、1、0.1μg/mL）的含药PDA平板，以等体积无菌水为对照。将直径5mm的病原菌菌饼接种到上述平板上，每处理3个重复，恒温25℃培养4d。采用十字交叉法测定菌落直径，并计算抑菌率。

抑菌率（%）=（空白对照菌落直径－药剂处理菌落直径）／（空白对照菌落直径－菌饼直径）×100。

1.5数据处理

利用SPSS软件进行数据处理，计算不同药剂的毒力回归方程、相关系数、抑制中浓度（EC₅₀值）等。采用MEGA 5.0软件对真菌ITS序列进行遗传分析。

2结果与分析

2.1水稻穗腐病病原菌形态特征

连续两年病原菌分离结果一致。如图1所示，分离病原菌在PDA培养基上菌落疏松呈白色，放射状扩展，后期呈墨绿、灰黑色，最后为黑色。菌丝分隔明显；分生孢子顶生在一个透明的瓶状细胞上，近球形，后期呈黑色，大小为（22.7～30.28）μm×（18.2～25.3）μm。

2.2水稻穗腐病病原菌分子鉴定结果

通过对测序结果进行BLAST序列比对发现，分离菌株SDSF与稻黑孢霉（Nigrospora oryzae）的同源性达100%（图2），结合菌株形态特征，将菌株鉴定为N.oryzae。

2.3水稻穗腐病的抗性

2020年和2021年两年稻黑孢霉菌株药剂敏感性测定结果（表1）显示，9种杀菌剂中，95%咯菌腈、95.3%丙环唑对对稻黑孢霉抑菌效果最好，2020年ECso值分别为0.2776、1.3102μg/mL，2021年ECso值分别为0.5171、2.0188μg/mL；98%吡唑醚菌酯、93.4%噻呋酰胺对稻黑孢霉抑菌效果较好，且两个药剂抑菌效果相当；80%代森锰锌可湿性粉剂抑菌效果差异较大，2020年EC₅₀值为8.0151μg/mL，2021年EC₅₀值为24.6704μg/mL；95.2%苯醚甲环唑、97%戊唑醇及95.1%嘧菌酯对稻黑孢霉的抑菌效果均较差；75%三环唑可湿性粉剂对稻黑孢霉无抑制作用。

3讨论与结论

本研究首次确定引起天津水稻主产区穗腐病的病原菌为稻黑孢霉（N.oryzae），与台莲梅、胡颂平、费丹等报道的稻黑孢霉是引起黑龙江、江西、安徽水稻穗腐病的主要病原菌之一结果相一致，今后在生产中应加强稻黑孢霉的监控和防治。除水稻穗腐病外，稻黑孢霉（N.oryzae）还会引起叶斑病、穗梗腐病、鞘枯病。

本试验中的苯醚甲环唑、戊唑醇、丙环唑、三环唑均为三唑类杀菌剂，能够抑制孢子萌发和附着孢形成，阻止病菌侵入和减少孢子的产生。稻黑孢霉对丙环唑的敏感性较高，EC₅₀值分别为1.3102μg/mL和2.0188μg/mL；其次为苯醚甲环唑和戊唑醇，两个药剂的抑菌效果相当；由于生产中水稻稻瘟病的防治药剂主要为三环唑，导致该病原菌抗性强，不适宜作为稻黑孢霉引起的水稻穗腐病防治的候选药剂。嘧菌酯和吡唑醚菌酯为甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，作用机理主要是通过阻止细胞色素间的电子传递，阻止三磷酸腺苷的形成，从而抑制线粒体的呼吸，达到杀菌的作用。本试验中吡唑醚菌酯对稻黑孢霉的抑菌效果好于嘧菌酯，这可能与生产中药剂使用频率相关。咯菌腈为苯基吡咯类杀菌剂，主要通过抑制病原菌葡萄糖磷酰化的转移，抑制病原菌的正常生长和代谢，导致病菌死亡：同时还能阻碍蛋白质与核酸的合成及细胞正常生物氧化过程，该药剂对稻黑孢霉抑菌效果显著，EC₅₀值<1μg/mL，生产中推荐使用。噻呋酰胺是新型的噻唑酰胺类杀菌剂，通过抑制病原真菌三羟酸循环中的琥铂酸脱氢酶，抑制病原菌的正常生长。代森锰锌可湿性粉剂为一种广谱保护性杀菌剂，作用机理为抑制病原菌细胞内丙酮酸氧化。噻呋酰胺与代森锰锌可湿性粉剂对稻黑孢霉抑菌效果相当。冯爱卿等测定了10种杀菌剂对稻黑孢霉的敏感性，其中10%苯醚甲环唑水分散粒剂、25%吡唑醚菌酯乳油及50%咯菌腈可湿性粉剂对稻黑孢霉菌的抑制效果最好。李戌清等研究發现75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂、325g/L苯甲·嘧菌酯悬浮剂、250g/L嘧菌酯悬浮剂对稻黑孢霉菌菌丝生长有较好的抑制作用。

综上，咯菌腈和丙环唑对稻黑孢霉抑菌效果最好，其次为吡唑醚菌酯和噻呋酰胺，该4种杀菌剂均可作为生产中防治稻黑孢霉的候选药剂。80%代森锰锌可湿性粉剂两年的抑菌效果差异较大。苯醚甲环唑、戊唑醇及嘧菌酯由于在生产中使用较为频繁，效果略差；75%三环唑对稻黑孢霉无抑制作用。本试验为天津地区由稻黑孢霉引起的水稻穗腐病的防治提供了一定的科学依据。