血清外泌体中miR-301a与糖尿病肾病腹膜透析后心脑血管事件的相关性

卫志锋,韩小丽,智云霞,刘俊芬,潘 星,程锦绣,金玉杰,刘圣君

(河北北方学院附属第一医院肾内科,河北张家口 075000)

据调查显示,全球约30%～50%终末期肾病患者病因为糖尿病肾病[1],中国中老年人终末期肾病的首要病因亦是糖尿病肾病[2]。心脑血管事件是糖尿病肾病腹膜透析死亡的首要原因,约40%～60%死亡与其有关[3]。探究糖尿病肾病腹膜透析患者发生心脑血管事件的预测指标有着重要意义。

外泌体是一种由细胞分泌的具备脂质双层膜结构的囊泡,内含蛋白、微小RNAs(microRNAs,miRNAs)等多种物质,主要负责细胞间信息传递[4]。miRNAs是一类由18～24个核苷酸构成的RNA,可通过调控靶基因参与疾病发生发展[5]。miR-301a作为其中一员,已被证实与心脏损伤及修复、血管内皮细胞凋亡、炎症及氧化应激损伤等有关[6-9]。上述因素均与心脑血管事件密切相关,推测miR-301a参与了糖尿病肾病腹膜透析后心脑血管事件。目前鲜有研究分析miR-301a与糖尿病肾病腹膜透析后心脑血管事件的关系。本研究主要分析糖尿病肾病患者血清外泌体中miR-301a与腹膜透析后心脑血管事件的关系,以期为心脑血管事件的预防和管理提供帮助。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取河北北方学院附属第一医院2019年6月至2020年6月接受腹膜透析治疗的211例糖尿病肾病患者作为研究对象。纳入标准:①因糖尿病肾病进展为终末期肾病;②接受腹膜透析治疗时间＞3个月。排除标准:①有心脑血管疾病家族史、恶性肿瘤;②入组前3个月内有腹膜炎及感染性疾病史;③临床资料不完整;④血液系统疾病或自身免疫性疾病;⑤入组前3个月内有冠心病史、急性心力衰竭史或脑卒中史等。本研究为前瞻性队列研究,患者均签署知情同意书,符合《赫尔辛基宣言》,获医学伦理委员会批准。

1.2 主要试剂

Exosome提取试剂盒购自美国SBI公司;Trizol试剂和逆转录试剂盒购自日本Takara公司;miR-301a和U6引物由上海吉玛制药技术有限公司设计。

1.3 信息收集

收集患者年龄、性别、体质量指数(body mass index,BMI)、吸烟史、糖尿病病程、高血压史、透析时长、入组时的血清白蛋白和超敏C 反应蛋白(highsensitivity C -reactive protein,hs-CRP)水平等信息。

1.4 血清外泌体鉴定及其中miR-301a水平检测

于患者入组后首次透析前,抽取肘部静脉血10 m L,离心后提取血清,置于-80℃冰箱中保存。用Exosome提取试剂盒提取血清中外泌体,用透射电镜观察、粒径分析和蛋白标志物CD63 鉴定外泌体。用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTqPCR)法检测血清外泌体中miR-301a 水平。用Trizol试剂提取RNA,用逆转录试剂盒将RNA 逆转录为cDNA。用PCR 仪扩增cDNA,扩增条件95℃预变性30 s,95℃变性15 s,55℃退火20 s,72℃延伸20 s,40 个 循 环。miR-301a 上 游 引 物:5＇-GCCGAGCAGTGCAATAGTATTG-3＇,下 游 引 物:5＇-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3＇;U6 上 游 引 物:5＇-CTCGCTTCGGCAGCACA-3＇,下游引物:5＇-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3＇。用 2-ΔΔCt法 计 算miR-301a相对内参U6的表达水平。

1.5 随访及心脑血管事件的定义

于患者首次透析后3个月采用复诊和电话方式随访,每3个月随访1次,随访2年,随访终点为随访期间发生心脑血管事件或至末次随访结束。心脑血管事件包括急性冠脉综合征、心力衰竭、持续性心律失常、脑卒中、外周血管疾病及心脑血管相关死亡。

1.6 统计学处理

研究数据用SPSS 23.0软件分析。正态分布的计量资料用均数±标准差(±s表示,非正态分布的计量资料用中位数和四分位数间距[M(Q1,Q3)]表示。高miR-301a组与低miR-301a组的组间比较分别用独立样本t检验和Mann-WhitneyU检验分析。计数资料用例(%)表示,组间差异用χ2检验分析。用Spearman分析miR-301a与hs-CRP相关性。用线性回归分析miR-301a 的相关影响因素。用Kaplan-Meier和Log-Rank比较miR-301a不同水平组间的累积心脑血管事件发生率,用COX回归和限制性立方样条分析miR-301a与糖尿病肾病腹膜透析后心脑血管事件的水平-效应关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 患者的临床资料及预后

患者中位年龄47(41,52)岁;男性118例,女性93例;中位BMI为25.91(22.81,28.01)kg/m2;吸烟史102例;中位糖尿病病程7(7,8)年;高血压史51例;中位透析时长6(5,8)月;血清白蛋白(38.05±6.82)g/L;中位hs-CRP为5.82(4.59,7.03)mg/L。

末 次 随 访 时 间2022 年6 月28 日,期 间37 例(17.54%)发生心脑血管事件,其中急性冠脉综合征16例,心力衰竭3例,持续性心律失常1例,脑卒中10例,外周血管疾病2例,心血管相关死亡5例。

2.2 血清外泌体鉴定结果

透射电镜下外泌体形态呈盘状(图1A),多数粒径约为100 nm(图1B),蛋白标志物CD63阳性(图1C)。

图1 外泌体鉴定结果Fig.1 Exosome identification results

2.3 患者miR-301a水平及分组情况

RT-qPCR 实验结果显示,患者中位miR-301a水平为1.46(1.31,1.60)。根据miR-301a中位数将患者分为低miR-301a组(≤1.46,n=108)和高miR-301a组(＞1.46,n=103)。

2.4 miR-301a不同水平组间患者的临床资料比较

2组的年龄、性别构成、BMI、吸烟史占比、高血压史占比、糖尿病病程和血清白蛋白水平差异均无统计学意义(P＞0.05)。低miR-301a组的hs-CRP水平和透析时长均低于高miR-301a组(P＜0.05,表1)。

表1 2组临床资料的比较Tab.1 Comparison of the clinical data in the two groups

2.5 miR-301a的相关影响因素

miR-301a与hs-CRP呈正相关关系(rs=0.237,P=0.001,图2)。患者miR-301a水平不服从正态分布,故将其进行对数转换。将hs-CRP和透析时长纳入线性回归进行分析,结果显示,hs-CRP 与miR-301a独立相关(P＜0.05,表2)。

表2 miR-301a的相关影响因素Tab.2 Factors associated with the effect of miR-301a

图2 miR-301a与hs-CRP散点图Fig.2 Scatter plot of miR-301a and hs-CRP

2.6 2组累积心脑血管事件发生率的比较

低miR-301a组的累积心脑血管事件发生率为3.70%(4/108),低于高miR-301a组[32.04%(33/103),Log-Rankχ2=29.508,P＜0.001,图3]。

图3 2组的累积心脑血管事件发生情况Fig.3 Cumulative cardiovascular events in the two groups

2.7 糖尿病肾病腹膜透析后发生心脑血管事件的风险因素分析

将是否发生心脑血管事件作为因变量,将年龄、性别、BMI、吸烟史、高血压史、糖尿病病程、血清白蛋白、hs-CRP、透析时长和miR-301a作为自变量,分别纳入COX 回归分析。结果显示,血清白蛋白、hs-CRP和miR-301a与糖尿病肾病腹膜透析后发生心脑血管事件有关(表3)。将是否发生心脑血管事件作为因变量,将血清白蛋白、hs-CRP和miR-301a作为自变量,一并纳入COX 回归分析。结果显示,高血清白蛋白水平是糖尿病肾病腹膜透析后发生心脑血管事件的独立保护因素,高hs-CRP 水平和miR-301a＞1.46是糖尿病肾病腹膜透析后发生心脑血管事件的独立危险因素(表3)。

表3 糖尿病肾病腹膜透析后发生心脑血管事件的风险因素分析Tab.3 Analysis of risk factors for cardiovascular and cerebrovascular events after peritoneal dialysis in diabetic nephropathy

2.8 miR-301a与糖尿病肾病腹膜透析后心脑血管事件的水平-效应关系

限制性立方样条拟合COX 回归分析结果显示,当miR-301a节点个数为3时,赤池信息准则值最小(346.175),此时,miR-301a与糖尿病肾病腹膜透析后心脑血管事件有关(χ2=12.91,P=0.002),呈非线性关系(χ2=5.97,P=0.015)。以miR-301a中位数作为参考点,当miR-301a＜1.46时,糖尿病肾病腹膜透析后发生心脑血管事件风险低;当miR-301a＞1.46时,糖尿病肾病腹膜透析后发生心脑血管事件风险高(图4)。

图4 miR-301a与糖尿病肾病腹膜透析后心脑血管事件的水平-效应关系Fig.4 Level-effect relationship between miR-301a and cardiovascular and cerebrovascular events after peritoneal dialysis in diabetic nephropathy

3 讨 论

心脑血管并发症是糖尿病肾病患者的主要并发症之一,亦是其死亡的主要原因。有研究报道,红细胞分布宽度、天冬氨酸转氨酶/丙氨酸转氨酶比值及可溶性人基质裂解素2等与腹膜透析心血管事件有关,但不同研究结论不尽相同[10-13]。目前,可用于预测腹膜透析后心脑血管事件发生的证据十分有限。本研究主要分析糖尿病肾病患者血清外泌体中miR-301a与腹膜透析后心脑血管事件的关系。

既往关于miR-301a的研究多集中在肿瘤方面,其被报道与非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌及胶质母细胞瘤等进展有关[14-16],鲜有关于其与糖尿病肾病腹膜透析后心脑血管事件的报道。miR-301a可调控磷酸酶和张力蛋白同源物/磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路诱导细胞周期G1/S转换,促进心肌细胞增殖,从而修复心肌梗死后心脏损伤[6]。miR-301a在Toll样受体激活的巨噬细胞中的表达降低,其可通过靶向核因子κB抑制因子调控核因子κB 活性及其下游促炎基因表达,如环氧化酶-2、前列腺素E2和白细胞介素6等[8]。此外,miR-301a-3p还可通过靶向KLF样转录因子7加重氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞氧化应激、炎症和细胞凋亡[9]。本研究结果显示,低miR-301a组的hs-CRP 水平低于高miR-301a 组,miR-301a 与hs-CRP 呈 正 相 关 关系,hs-CRP 与miR-301a独立相关。上述结果提示miR-301a与炎症损伤密切相关。氧化应激、炎症及其诱发的血管内皮细胞凋亡等与心脑血管事件密切相关[17],推测miR-301a通过调控炎症因子表达,如hs-CRP,参与血管内皮损伤,进而诱发心脑血管事件。本研究结果还显示,低miR-301a组的累积心脑血管事件发生率低于高miR-301a组,提示miR-301a与糖尿病肾病腹膜透析后心脑血管事件有关。此外,COX 回归分析结果显示,miR-301a＞1.46是糖尿病肾病腹膜透析后发生心脑血管事件的独立危险因素,限制性立方样条拟合COX 回归分析结果显示,miR-301a与糖尿病肾病腹膜透析后心脑血管事件呈非线性关系。上述结果进一步说明miR-301a与糖尿病肾病腹膜透析后心脑血管事件有关,miR-301a高水平提示患者发生心脑血管事件风险增加。

既往研究结果显示,血清白蛋白和hs-CRP水平与腹膜透析患者心血管事件有关,低血清白蛋白和高hs-CRP 水平的患者发生心血管事件的风险增加[18-19]。本研究结果显示,高血清白蛋白水平是糖尿病肾病腹膜透析后发生心脑血管事件的独立保护因素,高hs-CRP水平是糖尿病肾病腹膜透析后发生心脑血管事件的独立危险因素,与上述报道结果一致。

本研究尚存在一定不足,如仅检测了单次miR-301a水平,未对其进行纵向研究;为单中心研究,随访时间有限,还需开展多中心、长期随访研究以验证结论。此外,未开展基础研究分析miR-301a参与糖尿病肾病腹膜透析后心脑血管事件的病理生理机制。课题组后续将针对上述不足进行补充。

综上所述,hs-CRP与糖尿病肾病腹膜透析患者miR-301a独立相关。miR-301a水平高提示糖尿病肾病腹膜透析后发生心脑血管事件风险高。