清肺化痰汤治疗支气管扩张症的机制探讨*

玉结珍，杨红梅，赵清鸿，王柳乂，秘啸然

1 广西中医药大学 广西南宁 530001

2 广西中医药大学附属瑞康医院 广西南宁 530011

支气管扩张症对应中医诊断学“肺痈”“咳嗽”“咯血”等内容，中医经典《诸病源候论·肺痈候》认为该病因寒邪侵袭肺，与血液相搏，结成了痈，再加上热邪积聚，遂形成了脓。有学者认为本病以阴虚为本，邪热为标，主张清肺化痰、清火养阴为主。广西名中医陈斯宁教授创立的科内协定处方清肺化痰汤，方药组成及剂量如下：桑白皮、黄芩、瓜蒌壳、浙贝母、杏仁、苏子、半夏、茯苓各10g，鱼腥草20g，瓜蒌仁、甘草各6g，有止咳平喘、清肺化痰功效，方中主药桑白皮、黄芩能起到清泻肺热作用；浙贝母、瓜蒌壳、鱼腥草、瓜蒌仁化痰清热，是不可或缺的辅药；作为重要的佐药杏仁、半夏、苏子降气化痰平喘，茯苓可以健脾渗湿，与甘草祛痰止咳。多项临床研究发现清肺化痰汤可以降低慢阻肺痰热壅肺证急性发作患者的C反应蛋白，改善肺通气功能，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）以及各类血清炎症因子等的表达受到抑制，使气道炎症得到控制，还能降低患者血清丙二醛（MDA）水平、升高超氧化物歧化酶（SOD）水平，达到提高抗氧化能力的作用[1-4]。

支气管-肺组织感染以及支气管的阻塞是支气管扩张症的重要病理因素，治疗该病最主要是控制其炎症反应[5]。网络药理学是通过多种数据库搜索出方药的多种有效成分、药物与疾病的核心基因，构建网络，最终剖析药物作用于疾病的生物过程和作用通路，从而阐明药物从多种途径和多个靶点治疗疾病的作用机制[6]。本文通过网络药理学，研究清肺化痰汤药物中多个有效成分治疗支扩的作用机理，寻找出清肺化痰汤治疗慢性呼吸系统疾病的新靶点、新通络。

研究方法

1 清肺化痰汤活性成分以及作用靶基因的选择

清肺化痰汤活性成分通过中药数据库平台TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）获取，选出生物口服利用度OB≥30%并且类药性分析DL≥0.18的活性成分，为得到药物活性成分靶基因，翻阅相关资料，去掉没有相应靶点的活性成分，最后获得的基因在UniProt进行标准化，为下一步构建药物与疾病网络做准备。

2 清肺化痰汤活性成分和靶基因网络的构建

利用得到的清肺化痰汤有效成分及标准化后的靶基因，制作Network和Type表格，导入Cytoscape3.7.2软件上，构建药物活性成分-靶基因网络，设置Degree值，遴选出重要活性成分。

3 获取支气管扩张症相关基因，得到支气管扩张症-清肺化痰汤疾病共同基因

为获取支气管扩张症有关的基因，利用OMIM（https：//www.omim.org）、GeneCards（https：//www.genecards.org）两个疾病数据库，以“Bronchiectasis syndrome”为关键词进行搜索，疾病-药物共同基因需要取两个数据库得到的交集，删除清肺化痰汤重复靶基因，韦恩图利用疾病与药物靶基因在Venny（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/ve）在线平台上绘制。

4 制作PPI蛋白互作网络，药物-疾病核心基因需要将药物疾病交集基因导入Cytoscape3.

7.2软件上进行网络拓扑分析后获取STRING（https：//string-db.org/）网络在线平台可获取药物-疾病交集基因，即将药物靶基因和疾病靶基因导到该平台，选择最低相互作用的阈值“Medium Confidence”为 0.4，蛋白属种为“Homo Sapiens”，其他参数不变，将下载的TSV文件导入Cytoscape3.7.2软件，利用CytoNCA插件进行网络拓扑分析，选择中度中心性DC、局部边连通性LAC、接近中心性CC和特征向量中心性EC数值中位值，介度中心性BC值2倍的中位值进行设置，最后获得相应的核心基因。

5 核心基因的GO功能注射以及KEGG通路分析在微生信网站平台上进行

利 用 微生 信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）网站平台，将清肺化痰汤-支气管扩张症核心基因导入到网站平台中，对生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）分别进行注释，设置P-value值＜0.05，并且基因富集个数BP大于个，CC大于3个，MF大于3个，得到最终502个生物过程，分别选取3个生物过程中的前10个，绘制柱状图。设置P-value值＜0.05，基因富集数大于4个，进行KEGG富集通路的分析，最终获得99条通路。根据结果选取前40个KEGG通路制作富集气泡图。

研究结果

1 筛选清肺化痰汤活性成分

通过TCMSP平台搜索清肺化痰汤各个药物，查阅文献，去除无相关靶点信息的活性成分，获得活性成分247个，根据MOID搜索获得靶基因共274个。有效成分统计半夏13个，茯苓15个，栝楼11个，黄芩36 个，苦杏仁18个，桑白皮32个，鱼腥草7个，浙贝母7个，紫苏子16个，甘草92个。可知清肺化痰汤通过多靶点、多成分发挥其作用。

2 构建清肺化痰汤有效成分和靶蛋白基因的网络图

将药物有效成分和靶蛋白基因制作属性文件，导入Cytoscape3.7.2软件中，设置参数值获得相应的网络图，见图1（四边形代表清肺化痰汤药物，菱形四边形代表预测靶点，菱形六边形代表化合物，A1、B1、C1代表清肺化痰汤中药物共有成分），根据网络，设置degree值大小，该值与预测靶点之间的关系呈正相关，值越大关系越密切。最后根据Degree的值（50～153）选取清肺化痰汤关键成分，见表1。

表1 清肺化痰汤关键成分信息

图1 清肺化痰汤药物-成分-靶点网络结果

3 支气管扩张症疾病基因靶点分析，获取药物与疾病共同基因

支气管扩张症疾病基因通过OMIM、GeneCards两个疾病数据库获得，将所获得的疾病基因全部导入表格，通过删除重复值功能最终得到1289个疾病基因，清肺化痰汤药物与支气管扩张症交集基因利用Venny2.1网络在线平台获取，共获得共同基因77个。如图2所示。

图2 清肺化痰汤药物与支气管扩张症共同靶基因

4 药物与疾病蛋白网络构建结果分析，获取药物-疾病核心基因

药物与疾病蛋白网络在STRING网络在线平台上获取，如图3所示。将得到的TSV软件导入Cytoscape3.7.2软件中，核心基因药物-疾病核心基因通过CytoNCA网络插件获得，设置相应的参数值，得到JUN（AP-1 转录因子亚单位）、MMP-9（基质金属蛋白酶-9）、AKT1（AKT 丝氨酸/苏氨酸激酶 1）、IL6（白细胞介素6受体）、CXCL8（白细胞介素8受体）IL10（白细胞介素10受体）、TNF（肿瘤坏死因子）、TP53（肿瘤蛋白 P53）等核心基因，可知清肺化痰汤通过上述核心基因发挥其作用。

图3 药物与疾病共同基因PPI蛋白网络分析

5 GO 功能注释结果分析

清肺化痰汤-支气管扩张症核心基因导入微生信在线网站平台，分别进行分子功能、生物过程、细胞组分GO功能注释，设置相应的参数，得到502个生物过程。涉及细胞对生长因子刺激的反应、RNA聚合酶II转录调控复合物、细胞因子、质膜蛋白复合物、蛋白磷酸酶结合等生物过程，如图4，见表2。

表2 GO功能注释和KEGG通路富集分析结果

图4 GO 功能注释分析

6 KEGG 通路富集结果分析

根据KEGG通路富集结果分析得出清肺化痰汤-支气管扩张症主要富集在toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、白介素-17信号通路、以及糖尿病并发症中的AGE-RAG信号通路、MAPK信号通路等通路。其中TNF信号通路参与的基因有AKT1，IL1B，IL6，JUN，MMP9，MAPK3，PTGS2，CCL2，CASP3，TNF。toll样受体信号通路有 AKT1，IL1B，IL6，CXCL8，JUN，MAPK3，TNF基因参与等。如图5所示，见表2。

图5 KEGG 通路富集分析

讨 论

1 支气管扩张症相关发病机制

恶性循环假说论述了支气管扩张症发病过程，强调了感染、炎症和酶作用三个重要环节[7]。气道炎症是支气管扩张症发生和发展的核心。相关研究表明，中性粒细胞炎症作为支气管扩张症患者气道炎症的重要环节，主要通过生成趋化因子和细胞因子，促进蛋白酶和微生物肽的释放，导致机体发生炎症反应[8-9]。而对于气道炎症，西医多采用抗生素抗感染治疗，但长期盲目使用抗生素控制感染容易出现细菌多重耐药情况，以及药物不良反应的发生[10]。因此有关酶作用和气道炎症的研究对研发新药物治疗支气管扩张症有显著意义。

2 清肺化痰汤活性成分的作用机制

在药物-成分-靶蛋白基因网络中分析得出山萘酚、芒柄花黄素、槲皮素、豆甾醇、桑辛素F、以及黄芩素、β-谷固醇等关键成分。研究表明不仅促炎酶活性，受山奈酚的调控，还有相关炎症基因的表达也受到山奈酚的调控，其发挥抗炎作用主要与抑制转录因子、基质金属蛋白酶等有关[11]。山奈酚可以降低白细胞介素-8 和干扰素诱导蛋白-10、等炎症因子释放，来发挥抗炎作用，过程与PI3K、MAPK和Janus 激酶/信号转导以及转录激活通路相关[12]。研究表明豆甾醇起到抗炎作用，与抑制环氧化酶-2的表达，促进一氧化氮合酶的表达密切相关[13]。有研究证明黄芩素具有抗氧化应激、抗炎、保护肝脏、神经元和心脑血管等生物学的作用[14]。研究发现槲皮素有抗炎、抗病毒作用[15]。由此可知上述清肺化痰汤关键成分在治疗支气管扩张症中发挥重要的抗炎作用。

3 清肺化痰汤治疗支扩的靶点预测

由PPI蛋白互作网络结果，得出清肺化痰汤与支气管扩张症共同基因，然后通过CytoNCA进行网络拓扑分析，最终获得清肺化痰汤作用于支气管扩张症的核心基因可能为JUN（AP-1 转录因子亚单位）、AKT1（AKT 丝氨酸 /苏氨酸激酶 1）、MMP-9（基质金属蛋白酶-9）、IL6（白细胞介素6受体）、IL10（白细胞介素10受体）、VEGFA（血管内皮生长因子A）、MAPK3（丝裂原活化蛋白激酶3）、TNF（肿瘤坏死因子）等。相关文献发现支气管扩张症中基质金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶好及半胱氨酸蛋白酶失衡，会出现一定的肺功能障碍等[16-18]。丝氨酸蛋白酶可以通过蛋白水解来激活生长因子，不仅可以切割粘附分子，还有助于淋巴细胞的活化[19]。有研究发现IL-8活性受MMP-9激活调控[20]。有研究发现IL-6能够引起炎症反应，作用机理是加速B细胞增生分化，生成抗体[21]。CXCL8和TP53与肿瘤、癌症相关，可以影响细胞的增殖、生长、侵袭和迁移[22-23]，通过抑制TP53减轻上皮细胞的凋亡和肺部炎症[24]。

4 清肺化痰汤作用的生物过程和信号通路

通过GO功能注释分析结果获得核心基因主要富集于细胞对生长因子刺激的反应、RNA聚合酶II转录调控复合物、质膜蛋白复合物、蛋白磷酸酶结合等生物过程是对核心基因进行GO功能注释的结果。多个生物学进程涉及了 AKT1、IL6、CXCL8、IL10、VEGFA、MAPK3、PTGS2、TNF、TP53等核心靶点。蛋白酶作为支气管扩张症多种作用机制中的分子，在调节炎症、对抗感染以及参与肺组织重塑中发挥着重要作用[25]。通过 KEGG 通路结果分析，清肺化痰汤-支气管扩张症核心基因主要富集在肿瘤坏死因子通路、IL-17信号通路、MAPK 信号通路、toll样受体信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路中。有研究表明可以通过抑制 MAPK 信号，从而抑制炎性反应，抑制细胞的凋亡[26]。toll样受体信号通路需要Toll-IL 1受体（TIR）含结构域的适配器蛋白（TIRAP），蛋白激酶以及转录因子来传递信号，通过激活MAPK（丝裂原激活的蛋白激酶）和NF-κB来抑制炎症反应。研究已证明p38 MAPK信号通路可以通过肿瘤侵袭、炎症反应等途径发挥在肺部疾病中的重要作用[27]。有研究发现抑制 p38 MAPK活化可以缓解平滑肌细胞增生从而改善气道的重塑[28]。

根据以上结果分析，网络药理学研究得出清肺化痰汤中多种药物含有β-谷固醇、桑辛素F、山萘酚、槲皮素、豆甾醇等成分，参与调控细胞对生长因子刺激的反应、RNA聚合酶II转录调控复合物、细胞因子、质膜蛋白复合物、蛋白磷酸酶结合等生物过程，主要核心基因有 MMP-9、TP53、IL10、MAPK1等，TNF信号通路、IL-17 信号通路、TLR信号通路是主要通路，还涉及的通路有糖尿病并发症中的AGE-RAG信号通路、MAPK信号通路，干预炎症反应和酶的作用及细胞因子活性等过程，发挥抑制炎症反应和减轻气管损伤和气道重塑的作用，其结果为临床应用及后续实验设计的优化等提供了重要的理论依据。