抗原呈递相关基因在银屑病皮损中的表达研究

杨凡芮，韩建文

（1.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010000；2.内蒙古医科大学附属医院，内蒙古 呼和浩特 010000）

银屑病是一种多因素诱发的免疫性疾病。特征性皮损是境界清楚、上附银白色鳞屑的红色斑块，局限或广泛分布。中国患病率为 0.47%，且呈现逐年增高趋势［1］。银屑病的发病机制极其复杂，包含免疫、遗传、环境等多种因素。目前已有越来越多的研究表明抗原呈递所引起的免疫因素在其发病过程中尤为重要，遗传学及免疫学研究发现：参与抗原呈递的一些相关基因（如HLA-C、ERAP1、CD1a）与银屑病的发病机制具有密切的关系。本研究拟以寻常型银屑病（psoriasis vulgaris，PsV）和泛发性脓疱型银屑病（generalized pustular psoriasis，GPP）患者为对象，研究皮损中ERAP1、HLA-C、CD1a 的表达水平，与健康对照的皮肤组织进行比较。探讨3 种基因在2 种类型银屑病中的表达及其在银屑病中的致病作用。

1 资料和方法

1.1 病例资料 选择2014 年至2019 年就诊于内蒙古医科大学附属医院皮肤科，经组织病理确诊的38例PsV 患者和21 例GPP 患者，所有患者取材前3 个月未经任何治疗，无系统性疾病、结缔组织疾病及肿瘤；并选取33 名健康人皮肤组织为对照组，3 组间的性别及年龄无统计学差异，见表1。所有实验标本为石蜡包埋组织。本研究通过医学伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

表1 研究对象的性别、年龄基本特征［±S/n（%）］

表1 研究对象的性别、年龄基本特征［±S/n（%）］

1.2 试剂 标准化免疫组化试剂盒，包括一抗（兔抗人ERAP1、HLA-C、CD1a 抗体），二抗（山羊抗兔血清）、显色剂等，购自Solarbio 公司。石蜡、甲醛、二甲苯等试剂购自上海国药集团。

1.3 方法

1.3.1 实验方法 所有标本均经福尔马林溶液固定48 小时，常规洗涤与脱水，石蜡包埋，（4～7）μm 厚切片，捞片于处理过的防脱片上，60 ℃烤干，4 ℃保存备用。具体操作按产品说明书进行，已知阳性对照及阴性对照均来自于我院皮肤科就诊人群，PBS 代替一抗作空白对照。免疫组化使用 Envision二步法，DAB 显色，苏木精复染，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜观察。通过显微镜拍照，采集样本相关部位，苏木素染细胞核为蓝色，DAB 显出的阳性表达为棕黄色。

1.3.2 结果评定 免疫组化染色后的病理片利用Image-pro plus 6.0 软 件（Media Cybernetics，Inc，Rockville，MD，USA）进行图像分析，选取相同的棕色作为判断所有照片阳性的统一标准，对每张照片进行分析得出每张照片IOD 值代表平均蛋白表达强度。阳性细胞比值=阳性面积/照片总面积。每张切片选择3 个视野取平均值作为最终统计用。

1.4 统计学方法 应用SPSS26.0 统计软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布的采用均数±标准差（±SD）表示，多组间的比较采用方差分析，不符合正态分布的资料采用中位数（四分位数）［M（P25，P75）］表示，多组独立样本比较选用Kruskal-Wallis秩和检验，进一步多组间两两比较选用两个独立样本的Mann-Whitney U 检 验（α ＜0.017）。HLA-C、ERAP1、CD1a 表达之间的相关性采用Spearman 相关分析，以检验水准 P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

HLA-C 在PsV 组、GPP 组、对照组中的阳性细胞比值分别为0.09（0.06，0.13）、0.05（0.02，0.08）和0.07（0.04，0.10），差异有统计学意义（P＜0.05）。两两比较，PsV 与GPP 组的差异有统计学意义（P ＜0.05）（表2）。3 组中的HLA-C 的平均蛋白表达强度IOD 值分别为157834.49（98023.56，215894.83）、86193.29（38543.91，142187.79）、111118.73（59200.77，141852.99），差异有统计学意义（P ＜0.05）。其中，PsV 与对照组、PsV 与GPP 组的差异有统计学意义（P ＜0.05）（表3）。

表2 HLA-C、ERAP1、CD1a 在PsV、GPP 皮损中表达的阳性细胞比值［M（P25，P75）］

表3 HLA-C、ERAP1、CD1a 在PsV、GPP 皮损中荧光平均蛋白表达强度IOD 比较［M（P25，P75）］

ERAP1 在PsV 组、GPP 组、对照组中的阳性细胞比值分别为 0.13（0.06，0.18）、0.10（0.06，0.13）、0.03（0.02，0.05），差异有统计学意义（P ＜0.05）。两两比较，PsV 与对照组、GPP 与对照组间的差异有统计学意义（P ＜0.05）（表2）。ERAP1 的平均蛋白表达强度IOD 值分别为192091.46（77072.75，258680.10）、100684.51（87829.41，194942.43）、37534.33（21187.75，70946.6583），差异有统计学意义（P ＜0.05）。其中，PsV 与对照组、GPP 与对照组间的差异有统计学意义（P ＜0.05）（表3）。

CD1a 在PsV 组、GPP 组、对照组中的阳性细胞比值分别为0.02（0.00，0.09）、0.01（0.00，0.03）、0.00（0.00，0.01），差异有统计学意义（P ＜0.05）。两两比较中，PsV 与对照组有统计学意义（P ＜0.05）（表2）。CD1a 的平均蛋白表达强度IOD 值分别为31494.78（4783.86，154509.35）、12090.99（6349.54，61491.74）、3714.05（1201.07，19573.10），差异有统计学意义（P ＜0.05）。其中，PsV 与对照组有统计学差异（P ＜0.05）（表3）。

为分析这3 种基因在皮损中表达的相关性，在PsV组中利用Spearman 相关进行分析。结果表示HLA-C 与CD1a 荧光IOD 值具有相关性（rs=0.370，P=0.022）（图1a）；ERAP1与CD1a荧光IOD值具有相关性（rs=-0.383，P=0.018）（图1b）；ERAP1 与HLA-C 荧光IOD 值无相关性（rs=-0.012，P=0.943）（图1c）。

图1 HLA-C、ERAP1、CD1a 在PsV 皮损中表达的相关性分析

3 讨论

银屑病是一种以 T 细胞介导的角质细胞增殖为特征的自身免疫性皮肤病，其发病机制目前尚不清楚。根据银屑病的临床特征，可分为寻常型、脓疱型、关节型和红皮病型银屑病，其中 PsV 占90%以上，GPP 较少见，可由PsV 发展而来并威胁人类生命健康［2］。

人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）是细胞表面主要组织相容性复合物（Major histocompatibility complex，MHC）的表达产物，具有高度多态性，可以改变内源性抗原呈递途径中与MHC-Ⅰ分子上同T 细胞受体（T cell receptor，TCR）结合的部位［3］。PSORS1 是银屑病的一个强遗传危险因素，该区域的HLA-Cw6 被公认为是与银屑病易感基因关联最强的等位基因之一。鉴于HLA-Cw6 在内源性抗原呈递途径中的作用，它可能与银屑病自身抗原有高度亲和力，诸如：LL-37 与黑素细胞的抗原（ADAMTSL）5 作为自身抗原支持T 细胞在银屑病发病机制中的中心作用［4］。许琼琼等［5］研究发现HLA-C*06：02 和rs118179173 之间的显著相互作用，以及HLA-C*06：02 与HLA-B：AA67 之间的显著交互作用。还验证了先前报道的基因相互作用，其中HLA-C 和ERAP1 之间的相互作用最为显著。

ERAP1 在内源性抗原呈递过程中起剪切作用，具有高度多态性，天然存在的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNPs）称为ERAP1 单倍型［6］。已经有许多国内外的学者研究发现，其蛋白产物之间存在多种氨基酸变化，使酶构象发生改变，从而影响酶的活性和底物结合。ERAP1 不同结构和位置的变异会导致异常多肽的出现，这些异常肽呈递给HLA等位基因时，会影响细胞免疫表达，并激活自身炎症级联反应从而导致银屑病的发生发展［7］。Arakawa等［8］研究发现ERAP1 风险单倍型增加产生依赖ERAP1 的自身抗原，增加了由HLA-C*06：02 呈递黑素细胞自身抗原的可能性，从而超过潜在自身反应性T 细胞的激活阈值，从而触发CD8+T 细胞介导的自身免疫性疾病。

此外，有证据表明朗格汉斯细胞在银屑病发病机制中发挥关键作用，具有CD1a 的组成性高表达和向T 细胞呈递脂质抗原的能力。自身抗原磷脂酶A2组IVD（PLA2G4D）有助于产生花生四烯酸等脂质代谢产物，参与银屑病皮损中非蛋白脂类自身抗原的产生。CD1 蛋白是一类非多态性抗原呈递分子，其编码基因位于 MHC 基因位点之外，该蛋白能够将来自自身和病原体的脂质及小分子物质作为抗原呈递给T 细胞，并激活相应的免疫反应。在银屑病患者中，血液中CD1a 限制性自身反应性T 细胞的数量比银屑病患者的非皮损区皮肤组织和健康对照皮肤中的增加。它们以CD1a 依赖的方式对PLA2G4D 产生的脂肪酸和溶血磷脂做出反应，产生IL-17A、IFN-γ 和IL-22［9］。肥大细胞是PLA2G4D 的主要细胞来源，它衍生的外质体将PLA2G4D 输送至树突状细胞。这些结果指出了更广泛的银屑病炎症模型，脂质抗原在银屑病的发展中也可能是有意义的自体抗原，外质体可以将潜在的脂质配体运输到邻近的抗原呈递细胞［10］。

先前的研究报道了HLA-C、ERAP1 的基因变异在不同人种中与PsV 关联的不同结果，强调了它们在该疾病发病机制中的重要性［11-13］。ERAP1 基因变异仅在携带HLA-C 等位基因的人群中与PsV 易感性相关。遗传研究和荟萃分析发现，ERAP1 基因变异与PsV 具有明显相关性［14］。Yanjie Fu［15］等人研究发现ERAP1 基因上SNP rs26653 可能与中国汉族人群的PsV 易感性呈正相关。Ji Hyung Kim［16］等人通过使用CD1a 转基因小鼠，证明了CD1a 控制银屑病的炎症反应。上述遗传学和免疫学证据均提示HLA-C、ERAP1、CD1a 是PsV 的重要关键分子，本研究发现在PsV 患者皮损中HLA-C、ERAP1、CD1a呈现高表达，证实3 种基因在银屑病中的重要作用。本研究结果表明HLA-C 与CD1a 蛋白表达强度呈正相关，ERAP1 与CD1a 蛋白表达强度呈负相关，提示这些基因之间存在潜在的相互作用，并非独立发挥作用。此外我们还发现GPP 患者的皮损中ERAP1 也呈高表达，并且与PsV 类似，提示抗原呈递在脓疱型银屑病的发病机制中可能也具有重要的作用。

我们的研究显示了HLA-C、ERAP1、CD1a 在PsV、GPP 和对照组中的蛋白表达，表明抗原呈递相关基因与银屑病的发生发展存在密切联系。但是仍需要更深入的研究来明确它们在银屑病发生、发展中的确切机制，以及抗原呈递在银屑病中的具体作用和可能的始动因素，为以后银屑病的预防、治疗提供帮助。