ICU环境中耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药性及同源性分析

罗卓跃 卢鲜萍 邓建平 段肖丽 吴晶 万露

[摘要] 目的 了解重癥监护病房（intensive care unit，ICU）环境中耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRPK）的分布及同源性，为有效防控院内感染提供依据。方法 2022年5月18日对黄石爱康医院ICU环境进行采样，监测CRKP定植情况，对ICU环境中的CRKP菌株及该病房已确诊感染CRKP患者携带病原菌进行耐药基因及同源性分析。结果 环境物表中CRKP分离率为12.90%，且与患者感染菌的耐药基因均主要为blaKPC-2型（占比83.33%），分析显示呈高度同源性，相似系数达92%～98%。结论 ICU环境物表中CRKP定植比例较高，多为泛耐药或全耐药且具有同源性，提示院内环境开展CRKP主动监测的重要性。

[关键词] 环境物表；耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌；耐药基因分型；同源性分析

[中图分类号] R37      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.08.023

Homology analysis of resistance and homology of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in the ICU environment

LUO Zhuoyue， LU Xianping， DENG Jianping， DUAN Xiaoli， WU Jing， WAN Lu

Department of Laboratory， Huangshi Aikang Hospita， Huangshi 435001， Huibei， China

[Abstract] Objective To understand the distribution and homology of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae （CRPK） in intensive care unit （ICU） environment， so as to provide the basis for effective prevention and control of nosocomial infection. Methods The ICU environment of Huangshi Aikang Hospital was sampled on 18th May 2022 to monitor CRKP colonization and to analyze the resistance genes and homology of CRKP strains in the ICU environment and pathogens carried by patients with confirmed CRKP infection in this ward. Results The separation rate of CRKP in the environment was 12.90%， and blaKPC-2 type was the main drug resistance gene in the bacteria infected with patients （83.33%）. The homology analysis showed high homology，and similarity coefficient reached 92%-98%. Conclusion The proportion of CRKP colonization in ICU ward environment is high， and most of them are pandrug-resistant or fully drug-resistant with homology， suggesting the importance of active monitoring of CRKP in hospital environment.

[Key words] Environment object table; carpenter-resistant Klebsiella pneumoniae; Drug resistance genotyping; Homology analysis

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KPN）是常见条件致病菌，广泛存在于医院环境中，可引起肺炎、血流感染、泌尿系统和神经系统的医院感染，且死亡率高，是医院感染的重要病原菌之一[1]。近年来，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）在世界范围内迅速流行[2-3]，已成为严重的公共卫生负担。2022年黄石爱康医院ICU病房在短时间内检出多例CRKP感染患者。为控制CRKP菌株继续传播，医院微生物学实验室协助院感办公室对ICU环境清洁消毒前进行多部位撒网式采样并对其结果进行分析，以便查找感染的根源，为医院感染防控提供依据，指导临床科室医务人员及时采取控制措施，防止交叉感染的发生，具体如下。

1  资料与方法

1.1  一般资料

2022年5月18日黄石爱康医院对重症监护病房（intensive care unit，ICU）环境物表与医务人员手进行采样，监测CRKP定植情况。采样点包括床单元周围环境的高频接触部位（床栏、床头柜、床单、枕套、被套、患者尿袋、心电监护仪及台面、治疗车台面及治疗盘、垃圾桶表面等）、公共区域（大门把手、洗手水池、洗手液支架及水龙头等）、护士站（桌面、病历夹、电脑、鼠标、键盘）、心电图机及推车等。本研究获得黄石爱康医院伦理委员会批准（伦理审批号：2022-HSAKYY-YXLL- LW-01）。

1.2  方法

1.2.1  检测方法  无菌拭子浸入无菌生理盐水后，根据WS/T367—2012《医疗机构消毒技术规范》[4]中的相关要求，对ICU病房未进行环境清洁消毒前多个部位撒网式按规范涂抹式采样，将采样棉拭子头以无菌方式装入10ml无菌营养肉汤（杭州滨和有限公司提供）中，将采样后的肉汤管置37℃孵育24h后转种于麦康凯平板（郑州安图生物工程股份有限公司提供）。次日选取特征菌落（粉红色、大而黏、有拉丝）转种麦康凯平板进行纯培养，37℃培养24h后送往黄石市中心医院进行质谱分析，同时用质控菌株KPN（ATCC700603）参与试验保证质量。检测结果与KPN的符合率在9.000以上的为待分析菌株。

1.2.2  菌株鉴定与药敏试验  用美国BD公司Phoenix100微生物鑒定药敏系统对已确定的KPN（已通过黄石市中心医院质谱分析）进行药敏检测，任何一种碳青霉烯抗菌药物耐药即为CRKP株。同时根据M100-Ed31抗菌药物敏感性试验性能标准[5]对亚胺培南、美罗培南进行药敏验证。

1.2.3  耐药基因（blaKPC）检测  将检出的CRKP菌株（包括患者及病房环境）集中送往第三方医学实验室进行耐药基因检测，采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测编码碳青霉烯酶（blaKPC-2、blaNDM-1、blaIMP）。采用宁波基内陆生物技术有限公司生产的肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗生素基因检测试剂，按说明书要求进行双向扩增，测序结果用BLAST进行序列比对以确定耐药基因亚型。

1.2.4  CRKP菌株同源性分析  将获得的PFGE图谱用BioNumerics 7.6数据库软件进行聚类分析[6]，用非加权配对算数平均法进行聚类，条带位置差异容许度选择1.5%，优化值选择1.5%，分析分型图谱，绘出聚类分析图。

1.3  统计学描述

采用EXCEL软件对审核校对后的数据进行整理，计数资料采用例数（n）和百分比（%）表示。

2  结果

2.1  不同环境样品中KPN的检出情况

环境样本中检出KPN菌株18例，检出率为16.51%（18/124）。其中患者床单元周围环境的高频接触部位类14例（其中床栏4例，气切雾化面罩、注射泵、尿袋、利器盒及医疗垃圾桶各2例）、诊疗器械类2例、医务人员工作服2例，占比分别为11.29%（14/124）、1.61%（2/124）、1.61%（2/124）。

2.2  耐药性分析

对环境中18株KPN菌株进行体外药敏试验，结果显示，16株对亚胺培南、美洛培南耐药，为CRKP耐药株，CRKP分离率为12.90%（16/124）；2株为碳青霉烯类抗生素敏感株。再将16株CKPK耐药株与8株患者感染的CRKP菌株的药敏结果进行比对分析，发现耐药谱基本一致，均表现为泛耐药或全耐药，见表1。

2.3  耐药基因分析

24株CRKP菌株（包括8例患者病原菌及16株环境菌株）聚合酶链反应均扩增出目的条带，通过测序及在线比对，有20株CRKP菌株的耐药基因型为blaKPC-2型，4株为blaNDM-1，检出率分别为83.33%（20/24）、16.67%（4/24），见图1。

2.4  同源性分析

对分离出的24株CRKP菌进行PFGE分型后得到20条电泳带（6株患者病原菌和14株环境标本），通过聚类分析，显示实验菌株高度相似，相似系数在92%～98%（85%为界值），见图2。

3  讨论

KPN广泛存在于医院环境中，是导致院内感染的重要条件致病菌。2020年中国CHINET网监测显示，在临床分离的肠杆科细菌中，CRKP已远超耐碳青霉烯类大肠杆菌成为排名第1的致病菌[7]。碳青霉烯类抗生素是治疗KPN重症感染的首选药物，然而随着碳青霉烯类抗生素的广泛应用甚至滥用，CRKP分离率逐年攀升[8]，且多为全耐药或泛耐药菌株，为临床治疗带来严峻挑战。

CRKP菌株可在患者床单元的空气及周围环境中长期定植，已成为引发病区内其他患者获得性感染的重要途径[9-10]。本研究对ICU病区清洁消毒前的环境物表进行采样，结果显示，在患者床单元高频接触部位、诊疗器械及医务人员工作服上均检出CRKP，且耐药谱与患者菌株基本一致。患者床单元高频接触部位检出CRKP的主要是床栏、气切雾化面罩、注射泵、尿袋、利器盒及医疗垃圾桶，提示CRKP可定植于患者周围环境物表中，且在患者四周近距离扩散，也可通过医疗操作远距离的散播，病房环境成为院内感染的重要途径。而且本研究在医务人员工作服上检出CRKP，说明工作服有可能成为播散病原菌的媒介，提示日常清洁消毒过程存在盲区，警示医务人员需注重工作服的清洁与消毒，并在接触多耐患者时加强隔离防护措施。

KPN医院耐药严重，已成为医院中的高致死率病原菌之一。本研究结果显示，16株环境物表CRKP菌与8株患者感染CRKP菌呈全耐药或泛耐药菌株，对碳青霉烯类、β内酰胺酶类、喹诺酮类等耐药率均达100%，对氨基糖苷类耐药率>85.0%，对氯霉素耐药率<30.0%。与沈威[11]研究结论基本一致。CRKP在临床治疗中已缺乏有效的药物治疗，充分说明强化管理抗菌药物合理应用的紧迫性以及提高耐药菌环境防控手段的重要性。

导致KPN对碳青霉烯耐药的碳青霉烯酶有多种，其中最主要的是质粒介导的KPC酶（编码基因为blaKPC）。研究表明，KPC-Kp与CC258克隆复合体密切相關，其中ST11型是中国参与blaKPC-2基因广泛流行的最主要型别[12]。本研究结果显示，检测出的24株CRKP菌株中有20例为blaKPC-2型阳性菌株，可见医院CRKP的主要耐药机制是产生blaKPC-2型碳青霉烯酶，这与我国其他相关报道一致[6]。本研究PFGE分型结果显示，同一病区不同患者、不同时间段、不同标本所检出的CRKP菌株、与病房环境中医务人员高频接触部位（包括工作人员工作服、患者床边医疗垃圾桶及利器盒等部位）检出菌株是相似度极高的克隆菌株，可推测污染源来自患者，通过医务人员工作路径接触传播到周围环境中，其他患者存在极大感染CRKP风险，说明CRKP菌株可通过克隆或通过质粒介导在病房内传播并长期稳定的定植在病房环境中。因此，将重点部门多重耐药菌环境筛查工作纳入院感办日常监测范畴，从而达到有效监控多重耐药菌院内感染情况，通过系列管控措施降低物体表面多重耐药菌的定值，从而减少患者感染的风险保障患者安全。

综上所述，CRKP耐药情况严重且能在ICU病房环境中长期定植，是引发医院感染的主要传播方式[11，13]。2018年全国细菌耐药监测网监测结果显示，2020年CRKP菌株的检出率为4.90%，2020年已上升至10.9%[14]。面对CRKP检出率持续增加的严峻形势，遏制CRKP的进一步流行传播迫在眉睫。但本研究仅对ICU单个病区进行监测，未对耐药菌株的传播途径进行跟踪分析，后续将通过对全院重点管控科室的多重耐药菌动态监测、主动监测以及分子水平的耐药基因检测等手段对其传播途径进行跟踪分析，为有针对性地制定合理有效的防控措施提供支持。

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（收稿日期：2022–08–29）

（修回日期：2023–02–20）