RegⅢγ修饰HuMSCs对柯萨奇B3病毒诱导的心肌炎炎性细胞浸润及心脏功能的影响

蹇 强,李 丹,程 玮,孙 敏

心肌炎是心脏炎症性疾病,也是扩张型心肌病的前兆,通常以细胞浸润为主要特征,若心肌炎症在急性期未消退,心脏可能由于心肌细胞坏死受到直接损害,肉芽肿性炎症引起的损伤或成纤维细胞的增殖和胶原沉积引起的纤维化,可能导致扩张型心肌病或充血性心力衰竭发生[1-2]。心肌炎病因包括感染性和非感染性,其中病毒感染是心肌炎的常见病因,病毒可能在遗传易感个体中诱发心肌炎,儿童更易患心肌炎,目前,引起病毒性心肌炎的病毒主要包括柯萨奇病毒B、人类免疫缺陷病毒1、流感病毒及甲型和丙型肝炎病毒等[3]。尽管在较多研究中应用了包括皮质类固醇在内的免疫抑制药物治疗病毒性心肌炎,但效果存在争议。

近年来,越来越多的实验和临床研究为应用细胞移植改善心肌功能的策略提供支持。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有抗凋亡、抗纤维化和促血管生成等作用。人脐带间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,HuMSCs)是从脐带动脉和静脉及内皮下、血管周围区域中分离出来的细胞,较其他干细胞的来源丰富,生物学性状稳定,具有低免疫原性等特点[4-5]。已有研究表明,HuMSCs移植可能通过调节内质网应激、细胞外信号调节激酶(ERK)1/2信号传导途径和抑制心肌细胞凋亡减轻急性心肌炎大鼠的心肌损伤和心脏功能障碍[6]。胰岛再生源蛋白Ⅲγ(islet regenerating Ⅲγ,RegⅢγ)是一种免疫炎症调节因子,在多种疾病或受损组织中表达,通过促进细胞增殖和抵抗细胞凋亡,发挥修复组织损伤的功能[7]。本研究通过慢病毒介导RegⅢγ感染HuMSCs,得到RegⅢγ修饰的HuMSCs,观察其对柯萨奇B3病毒(CVB3)诱导的心肌炎小鼠模型心脏功能及损伤的影响,以期为临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康无特定病原体(SPF)级雄性BALB/C小鼠40只,4周龄,由西安交通大学实验动物中心提供,饲养于无特定病原体屏障环境,温度为22～24 ℃,相对湿度为(50±5)%,12 h/12 h明暗周期交替。本研究获得我院伦理委员会审批。

1.2 实验试剂 RegⅢγ重组表达载体(PCDH-CMV-GFP-RegⅢγ)的构建、转染细胞及慢病毒包装过程均由上海捷瑞生物工程有限公司完成。胎牛血清(杭州四季青),DMEM/F12培养液和胰蛋白酶(美国HyClone公司),Trizol试剂盒(美国Thermo公司),Sensi Fast c-DNA 合成试剂盒和SensiFast SYBR Green Hi-ROX试剂盒(英国Bioline公司),酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司),苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司),免疫组织化学染色试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司),抗体CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、人类白细胞抗原-DR蛋白(HLA-DR)、CD4、CD8及CD68(英国Abcam公司),辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 HuMSCs的提取、培养及鉴定 收集我院妇产科无菌健康新生儿的脐带组织,磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤干净,剪成约1 mm3的组织块,加入胶原酶Ⅱ消化,筛网过滤,滤液以4 000 r/min离心10 min,弃上清,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液,置于37 ℃、体积分数5%CO2的恒温箱培养,3～5 d后换液,弃未贴壁细胞,继续培养,每隔2 d换液1次。倒置显微镜观察细胞,融合度达80%后胰酶消化,扩大培养。选择第3代细胞,流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD73、CD90及HLA-DR的表达。

1.3.2 慢病毒感染HuMSCs 将HuMSCs消化后,按照每孔5×104个细胞的密度接种于24孔板,放于37 ℃、体积分数5%CO2的恒温箱内,待生长至融合度达到80%时,在培养孔内加入含有过表达RegⅢγ的慢病毒悬液的培养液,混匀后,置于细胞培养箱,根据细胞生长状态,12～16 h更换培养液,感染24 h和48 h后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。

1.3.3 实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)实验 在感染后的HuMSCs中加入Trizol试剂液,按说明步骤提取总RNA,经分光光度计检测纯度与浓度后,根据Sensi Fast c-DNA合成试剂盒将总RNA逆转录合成cDNA。以获得的cDNA为模板,经过Rotor GeneQ荧光定量PCR仪进行扩增,检测RegⅢγ mRNA的表达水平,具体操作按照SensiFast SYBR Green Hi-ROX试剂盒说明书进行,以β-actin作为内参基因。扩增条件：95 ℃ 2 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 10 s,共40个循环。RegⅢγ和GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列：RegⅢγ正向引物5′-AAGGTTGATTCTTTCAGGGAGC-3′,反向引物5′-AGTGGATCTGAGTTAGGTCATGG-3′;β-actin正向引物5′-TGCGTGACATGAGAAG-3′,反向引物5′-GCTCGTAGCTTCTCCA-3′。使用2-ΔΔCt法计算目的基因表达量。

1.3.4 动物建模与分组处理 将40只小鼠按照随机数字表法分为对照组、模型组、HuMSCs组和RegⅢγ-HuMSCs组,每组10只。模型组、HuMSCs组和RegⅢγ-HuMSCs组均采用腹腔内注射200 μL含102半数组织培养感染剂量的CVB3病毒液建立心肌炎模型[8],对照组注射等量生理盐水。次日,HuMSCs组和RegⅢγ-HuMSCs组小鼠分别尾静脉注射100 μL的HuMSCs、RegⅢγ-HuMSCs,注射细胞数量均为1×106个,对照组和模型组小鼠均尾静脉注射100 μL的生理盐水。

1.3.5 心脏超声检查 14 d后,采用异氟烷麻醉4组小鼠,固定在手术台上,应用高分辨率小动物超声成像系统,采集并记录小鼠超声相关指标射血分数(ejection fraction,EF)、缩短分数(fractional shortening,FS)、左室舒张末期容积(end-diastolic volume,LVEDV)和左室收缩末期容积(left ventricular end-systolic volume,LVESV),通过系统软件进行处理数据。

1.3.6 ELISA实验 心脏超声检查完毕后,4组小鼠摘眼球取血,血液室温静置1h后,4℃条件下,以4 000 r/min离心10 min,取血清,根据试剂盒说明书操作,ELISA法检测各组血清白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10和IL-23含量。

1.3.7 HE染色 处死4组小鼠,解剖取其心肌组织,清洗干净后,采用4%多聚甲醛室温固定过夜。次日,梯度乙醇对心肌组织进行脱水,二甲苯透明,蜡块包埋,制作厚度约为4 μm的石蜡切片,采用HE染色对心肌组织石蜡切片进行染色,切片进行脱蜡水化后,加入苏木素染色5 min,流水冲洗干净,再用伊红染液复染3 min,脱水、透明后,中性树胶封片,光学显微镜下摄影并观察组织形态学结构变化情况。

1.3.8 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)染色 取制备的小鼠心肌组织石蜡切片,脱蜡水化后,将蛋白酶K与缓冲液混合进行稀释,使用100 μL的蛋白酶K工作液(20 μg/mL),37 ℃条件下孵育10 min,PBS漂洗干净,封闭液处理10 min,50 μL TUNEL试剂液孵育1 h。3,3′-二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染,脱水、透明后,中性树胶封片,光学显微镜下摄影并观察,随机选择5个视野,阳性染色为棕褐色,代表凋亡细胞,计数视野下阳性细胞与总细胞,以两者比值作为TUNEL阳性率。

1.3.9 免疫组织化学染色 将制备的4组小鼠石蜡切片进行常规脱蜡水化,置于柠檬酸盐液浸泡,进行高温修复抗原。3%过氧化氢溶液孵育10 min后,将切片用5%山羊血清室温封闭30 min。加入一抗T淋巴细胞表面抗原(CD4、CD8)和巨噬细胞特异性抗体(CD68)工作液,放于4 ℃下孵育过夜。次日,弃去一抗液,加入对应二抗工作液,室温继续孵育60 min。利用DAB法染色,苏木精复染5 min,分化数秒,自来水冲洗干净,脱水、透明后,中性树胶封片,光学显微镜下对免疫组织化学切片摄影,阳性染色呈棕色至棕褐色,应用Image Pro Plus 6.0软件测定阳性染色区域的平均吸光度值。

2 结 果

2.1 HuMSCs的鉴定结果 倒置显微镜下观察分离培养的细胞,第7天可见细胞较少,且聚集成团;第14天细胞明显增多,形状为典型的纺锤形。流式细胞术检测结果显示,细胞表面抗原CD44、CD73和CD90表达水平均较高,CD34、CD45及HLA-DR表达均较低。详见图1。说明成功分离到HuMSCs。

2.2 慢病毒感染HuMSCs效果测定 转染24 h、48 h后,倒置荧光显微镜观察到经过慢病毒感染的HuMSCs中均可见绿色荧光蛋白表达,48 h时表达明显,感染率达到98.4%。qRT-PCR检测结果显示,感染含RegⅢγ的RegⅢγ-HuMSCs组细胞中RegⅢγ mRNA表达水平高于未感染的对照组细胞(P<0.05)。详见图2。此结果说明已获得RegⅢγ修饰的HuMSCs。

2.3 RegⅢγ修饰HuMSCs对心肌炎小鼠心功能的影响 与对照组比较,模型组小鼠EF、FS降低,LVEDV、LVESV升高(P<0.05);与模型组比较,HuMSCs组和RegⅢγ-HuMSCs组EF、FS均升高,LVEDV、LVESV均降低(P<0.05);与HuMSCs组比较,RegⅢγ-HuMSCs组EF和FS均升高,LVEDV和LVESV均降低(P<0.05)。详见图3、表1。

图1 HuMSCs鉴定(A为倒置显微镜观察HuMSCs形态;B为流式细胞术检测HuMSCs表面抗原表达)

与HuMSCs组比较,＊P<0.05。图2 HuMSCs感染(A为倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达;B为qRT-PCR检测细胞RegⅢγ mRNA表达水平)

图3 各组小鼠心脏超声图像

表1 各组小鼠心功能指标EF、FS、LVEDV及LVESV比较(±s)

2.4 RegⅢγ修饰HuMSCs对心肌炎小鼠血清炎性因子水平的影响 ELISA检测结果显示,与对照组比较,模型组小鼠血清IL-2、IL-6和IL-23含量增加,IL-4和IL-10含量减少(P<0.05);与模型组比较,HuMSCs组和RegⅢγ-HuMSCs组血清IL-2、IL-6和IL-23含量减少,IL-4和IL-10含量增加(P<0.05);与HuMSCs组比较,RegⅢγ-HuMSCs组血清IL-2、IL-6和IL-23含量减少,IL-4和IL-10含量增加(P<0.05)。详见表2。

表2 各组小鼠血清炎性因子水平比较(±s) 单位：pg/mL

2.5 RegⅢγ修饰HuMSCs对心肌炎小鼠心肌组织病理损伤的影响 HE染色结果显示,对照组小鼠心肌组织内细胞形态规则,排列整齐,无炎性细胞浸润;模型组心肌组织内细胞排列紊乱,炎性细胞浸润明显,有坏死灶,且有部分血管渗出蛋白黏液;HuMSCs组心肌组织仍有炎性细胞浸润,但病理损伤较模型组减轻;RegⅢγ-HuMSCs组心肌组织内细胞排列较为整齐,结构清晰,未见明显炎性细胞浸润现象。详见图4。

图4 HE染色检测各组小鼠心肌组织病理损伤(200 μm)

2.6 RegⅢγ修饰HuMSCs对心肌炎小鼠心肌细胞凋亡的影响 TUNEL染色结果显示,对照组小鼠心肌组织内棕褐色细胞染色减少;相较于对照组,模型组小鼠心肌组织内有大量棕褐色细胞,TUNEL阳性率高于对照组(P<0.05);与模型组比较,HuMSCs组和RegⅢγ-HuMSCs组心肌组织棕褐色细胞减少,TUNEL阳性率降低(P<0.05);RegⅢγ-HuMSCs组TUNEL阳性率低于HuMSCs组(P<0.05)。详见图5、图6。

图5 TUNEL染色检测各组小鼠心肌细胞凋亡(50 μm)

模型组与对照组比较,＊P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;RegⅢγ-HuMSCs组与HuMSCs组比较,△P<0.05。图6 TUNEL染色检测各组小鼠心肌细胞凋亡比较

2.7 RegⅢγ修饰HuMSCs对心肌炎小鼠心肌组织CD4、CD8、CD68表达的影响 免疫组织化学染色结果显示,模型组小鼠心肌组织内CD4、CD8及CD68蛋白均呈强阳性表达,可见明显的棕褐色染色,CD4、CD8、CD68蛋白表达均高于对照组(P<0.05);HuMSCs组和RegⅢγ-HuMSCs组心肌组织内棕褐色染色强度较模型组减少,CD4、CD8及CD68蛋白表达降低(P<0.05);RegⅢγ-HuMSCs组CD4、CD8及CD68蛋白表达较HuMSCs组下降(P<0.05)。详见图7、图8。

图7 免疫组织化学染色检测心肌组织CD4、CD8、CD68表达(200 μm)

模型组与对照组比较,＊P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;RegⅢγ-HuMSCs组与HuMSCs组比较,△P<0.05。图8 免疫组织化学染色检测心肌组织CD4、CD8、CD68表达比较

3 讨 论

心肌炎是炎性细胞浸润到心肌组织,导致心脏功能恶化的风险增加,且临床表现具有异质性。心肌炎主要由病毒感染介导,也可由细菌、原生动物或真菌感染、多种有毒物质和药物及全身免疫介导的疾病所诱发。尽管目前进行了广泛研究,但并发左心室功能障碍、心力衰竭或心律失常的心肌炎,常出现危及生命的症状,包括恶性心律失常、心源性休克及猝死等[2,9]。由于心肌炎临床表现具有多样性和病因复杂性,需结合具体情况制定治疗方案,即对症支持治疗,在此基础上,包括主动脉内球囊反搏、体外膜肺氧合及心室辅助装置等在内的器械支持也是常用的治疗方法[10]。近年来,免疫抑制和抗病毒治疗在心肌炎的研究中得以运用,但这些方法的疗效均不理想。减轻心肌炎的炎症反应和抑制心肌细胞凋亡对提高心脏功能具有积极的意义。

HuMSCs除了具有自我更新能力外,同时表现出较小的免疫排斥反应,可用于同种异体移植,这些特征表明HUMSCs治疗自身免疫性疾病及修复组织损伤的潜力,并已得到证实。HUMSCs通过芳烃受体(AhR)调节宿主免疫和肠道微生物群之间的相互作用,在类风湿性关节炎大鼠中发挥治疗作用[11];HuMSCs调节通过转化生长因子β1/Smad家族成员3(TGF-β1/Smad3)信号途径参与抑制卵巢组织的纤维化,修复原发性卵巢功能不全大鼠的卵巢功能[12];鼻腔移植细胞球蛋白(CYGB)修饰HuMSCs后,通过蛋白38型丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)途径介导细胞凋亡改善新生大鼠缺氧缺血性脑损伤[13]。本研究超声心动图分析结果表明,经过CVB3诱导的小鼠EF和FS降低,LVEDV和LVESV升高,表明心肌收缩和舒张功能受损;CVB3诱导的小鼠中尾静脉注射HuMSCs后,EF、FS均升高,LVEDV、LVESV均降低。经过HuMSCs治疗后的小鼠心肌组织病理损伤减轻,炎性细胞浸润减少,心肌细胞凋亡受到抑制。由此说明,HuMSCs可抑制心肌炎小鼠炎症反应和心肌细胞凋亡,可改善心脏功能损伤。

Reg属于C类凝集素超家族,具有多种生物调节功能,如参与细胞增殖、凋亡、炎症反应及抗菌作用等。RegⅢγ作为该家族的成员,可对损伤组织起到修复作用。有研究表明,RegⅢγ可促进培养的结肠上皮细胞生长,并在成年小鼠的小肠中高表达,在葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎中发挥组织保护作用[14]。严重联合免疫缺陷小鼠中,肠道共生菌可活化RegⅢγ基因表达,由此推测其参与大肠炎发生中的先天免疫[15]。RegⅢγ可加快急性肝衰竭中的肝再生[16]。本研究结果显示,经过RegⅢγ修饰的HuMSCs治疗心肌炎小鼠后,相较于HuMSCs治疗比较,该作用引起EF和FS进一步升高,LVEDV和LVESV进一步降低,心肌组织病理损伤显著改善,组织结构清晰,且心肌细胞凋亡减少。这一结果表明,RegⅢγ修饰可促进HuMSCs对心肌炎小鼠心功能及心肌组织损伤的改善作用。

由于心肌炎的常见原因是病毒感染、细菌感染及自身免疫性疾病,且心肌炎中常观察到淋巴细胞和单核细胞浸润,并检测到促炎趋化因子、细胞因子等表达增加[17-18],因此,炎症反应是心肌炎主要病症之一,抑制炎性因子和炎性细胞浸润对改善心肌炎十分重要。本研究结果显示,在CVB3诱导的小鼠血清促炎因子IL-2、IL-6和IL-23含量均增加,抑炎因子IL-4和IL-10含量均减少,心肌组织内T淋巴细胞表面抗原CD4、CD8和巨噬细胞特异性抗体CD68表达增强,说明机体内发生炎症反应,心肌组织内炎性细胞浸润,以淋巴细胞和巨噬细胞为主。进一步通过尾静脉注射HuMSCs和RegⅢγ-HuMSCs治疗后,血清IL-2、IL-6和IL-23含量均减少,IL-4和IL-10含量均增加,心肌组织内CD4、CD8和CD68表达减弱。由此推测,RegⅢγ修饰的HuMSCs具有保护心肌炎小鼠心脏的作用,可能与抑制心肌炎性递质浸润有关。

综上所述,经RegⅢγ修饰可促进HuMSCs对CVB3诱导的小鼠病毒性心肌炎发挥心脏功能的保护作用,抑制血清炎症反应和组织内炎性细胞浸润,减少心肌组织细胞凋亡,为心肌炎的研究提供了新方向和理论支持,然而具体机制有待进一步阐明。