基于代谢组学探讨补阳还五汤治疗脑梗死恢复期气虚血瘀证的效应机制

赵钟辉,郭蓉娟,冉 超,朱晓晨

脑卒中是我国成年人致死、致残的首位病因,具有发病率高、致残率高、死亡率高和复发率高的特点[1],脑梗死又称缺血性脑卒中,居脑卒中发病率和死亡率的首位。随着现代医学的不断发展,急性脑梗死病人经积极救治后,存活率明显提高,但部分人留有偏瘫、失语等不同程度的神经功能缺损症状的病人进入恢复期,给家庭和社会带来了严重的负担。有研究表明,脑梗死后3个月内是病人神经功能恢复的最佳阶段,因此把握恢复期的治疗是提高脑梗死病人生活质量的关键[2-3]。现代医学降低了急性脑梗死病人死亡率,但对脑梗死恢复期的治疗目前尚无特效药物,而中医药以特有的优势广泛应用于该病的临床治疗中。中医学认为,脑梗死属于“中风病”范畴,恢复期多见本虚标实,本虚以气虚、阴虚为主,标实多为血瘀、痰湿。中医证候研究显示,气虚血瘀证是该病的主要中医证型[4],益气活血类中药治疗脑梗死恢复期具有优势,可改善病人神经功能缺损症状,补阳还五汤是治疗本病的经典方剂。本研究采用补阳还五汤用于恢复期脑梗死病人,通过临床疗效观察和代谢组学分析阐释其疗效并对其部分作用机制进行探讨。

1 资料与方法

1.1 诊断标准 脑梗死的西医诊断参照2018年中华医学会神经病学分会脑血管病学组制定的《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》[5]中的相关内容：急性起病,多为安静状态下起病;局灶神经功能缺损(一侧肢体或面部麻木或无力,语言障碍等),少数为全面神经功能缺损;影像学显示有责任缺血性病灶时症状或体征持续时间不限,缺乏影像学责任病灶时症状或体征持续24 h以上;排除非血管性病因;脑MRI/CT排除脑出血。

中医诊断参照2015年中华中医药学会制定的《中医临床诊疗指南释义·脑病分册》[6],①疾病诊断：临床表现为神志昏蒙、口舌歪斜、半身不遂、言语謇涩或语不达意、甚或不语、偏身麻木;出现眩晕、头痛、瞳神变化、饮水呛咳、目偏不瞬、步履不稳等。②病程诊断：急性期为发病2周以内,昏迷者可延长到发病4周;恢复期为发病2周至6个月;后遗症期为发病6个月后。③气虚血瘀证证候诊断参照《缺血性中风证候诊断表》[7],通过计算每个证候要素的每项症状得分,各项相加得到总评分,气虚血瘀证诊断标准是气虚量表评分≥10分,且血瘀量表评分≥10分。

1.2 纳入标准

1.2.1 脑梗死恢复期病人纳入标准 符合动脉粥样硬化性脑梗死的西医诊断标准;符合中风病中经络中医诊断标准,辨证为气虚血瘀证;缺血性中风证候诊断量表气虚评分≥10分且血瘀评分≥10分;美国国立卫生研究院卒中量表(National Institute of Health Stroke Scale,NIHSS)评分3～22分;年龄40～80岁;发病2周至6个月;病人自愿参与本研究并签署知情同意书。

1.2.2 健康受试者纳入标准 无任何临床症状;年龄40～60岁;与脑梗死恢复期组一般资料匹配;自愿参加并签署知情同意书。

1.3 排除标准 短暂性脑缺血发作、进展性脑卒中和心源性脑卒中;蛛网膜下腔出血或脑出血;急性期进行过机械取栓或溶栓等血管开通治疗;3个月内有过严重出血史或有消化性溃疡等;合并有肝肾功能、血液系统、内分泌系统、循环系统、呼吸系统和风湿免疫系统等严重疾病及合并严重骨关节性疾病;妊娠期妇女或准备妊娠,尿妊娠试验阳性,哺乳期妇女;精神障碍、智力障碍病人,昏迷病人,或聋、哑、盲等病人,不能配合检查;过敏体质或已知对本研究药物成分过敏;同时参加其他临床试验者或3个月内参加过其他临床试验。

1.4 一般资料 选取2019年1月—2019年10月于北京中医药大学东方医院脑病科住院及门诊就诊的脑梗死恢复期气虚血瘀证病人32例,按照随机数字表法分为治疗组和对照组,各16例,同时招募16名健康受试者。随访期间,治疗组脱落2例,对照组脱落1例,最终纳入治疗组14例,对照组15例,健康组16名。治疗组,男8例,女6例;年龄(61.64±8.96)岁;病程(4.57±3.06)周;体质指数(25.14±3.76)kg/m2。对照组,男8例,女7例;年龄(62.07±8.71)岁;病程(6.20±5.36)周;体质指数(26.64±3.51)kg/m2。健康组,男10名,女6名;年龄(61.38±7.62)岁;体质指数(26.41±4.88)kg/m2。3组一般资料比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.5 治疗方法 治疗组及对照组均在脑梗死恢复期的常规西医治疗基础上干预,治疗组予以口服补阳还五汤配方颗粒(黄芪60 g,当归尾20 g,地龙12 g,赤芍15 g,川芎12 g,桃仁12 g,红花12 g)治疗,早晚各1袋,治疗12周。对照组予以等量安慰剂(糊精和矫味剂)治疗,两组疗程一致。上述配方颗粒全部由华润三九药业有限公司统一制作。

1.6 观察指标及方法

1.6.1 疗效指标 分别在入组当天、治疗第12周末对研究对象进行缺血性中风证候要素量表评分和 NIHSS评分。①中医疗效评价：根据治疗前后气虚、血瘀证候积分变化,对两组差异进行统计分析。②西医疗效评价：根据治疗前后NIHSS评分变化,参照1995年全国第四次脑血管病学术会议制定的临床疗效评定标准[8]进行评定,基本痊愈：NIHSS评分减少90%～100%;显著进步：NIHSS评分减少46%～89%;进步：NIHSS评分减少18%～45%;无效：NIHSS评分减少或增加<18%;恶化：神经功能缺损评分增加>18%。

1.6.2 安全性指标 包括体温、脉搏、呼吸、血压等生命体征,血、尿常规,肝肾功能,心电图,并详细记录研究中出现的任何不良反应。

1.6.3 血清代谢组学检测 将50 μL血清样本加入含有内标(甲醇∶乙腈=1∶1)的沉淀剂450 μL中,涡旋混匀60 s;以4 ℃,13 000 r/min离心10 min后吸取上清液100 μL,置于Thermo Q EXACTIVE液质联用系统中准备进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析。仪器名称：DIONEX Ultimate 3000超高效液相色谱仪。色谱柱：ACQUITY BEH C18 1.7 μm,2.1 mm×50 mm。液相条件：水(含2 mmoL/L甲酸铵和0.1%甲酸),乙腈;梯度洗脱,分析时间0～18 min,进样量5 μL,流速0.25 mL/min。洗脱梯度程序：0～1 min,5%乙腈;1～5 min,5%乙腈;5～8 min,60%乙腈;8～11 min,100%乙腈;11～14 min,100%乙腈;14～15 min,60%乙腈;15～18 min,5%乙腈。样品质谱信号采集分别采用电喷雾电离(ESI)正负离子扫描模式,参数为喷雾电压3 000 V;蒸发温度350 ℃;鞘气35 Arb;辅助气10 Arb;毛细管温度320 ℃;S-lens RF50。监测模式：一级全扫描(Full scan),二级数据依赖性扫描(Full MS/dd-MS2)。参数：一级全扫描(Full scan)：分辨率：70 000;AGC target：1e6;Maximun TT：100 ms;扫描范围：质荷比(m/z)70～1 050。二级数据依赖性扫描(Full MS/dd-MS2)：分辨率：35 000;AGC target：1e5;Maximun TT：50 ms;碰撞能量(NCE)：20 eV、40 eV、60 eV。

血清代谢组学资料应用中国检验检疫科学研究院自建的Tracefounder软件对LC-MS/MS数据进行预处理,获得变量保留时间_质荷比(rt_mz)、分子量(comPMW)、观察量(样本)和峰强。将编辑后的数据矩阵导入MetaboAnalyst 4.0软件进行主成分分析(PCA)。变量投影重要性(variable importance in projection,VIP)反映每个变量对模型解释的贡献度,定义当代谢物的VIP值>1.0时,认为对模型有显著贡献。利用MetaboAnalyst 4.0软件分析VIP>1.0的主要差异代谢物,选择P>0.1作为影响的主要代谢通路。

2 结 果

2.1 NIHSS评分 与治疗前比较,两组治疗后NIHSS评分均降低(P<0.05);治疗后,两组NIHSS评分比较,差异无统计学意义(Z=-0.671,P=0.561)。详见表1。

表1 两组治疗前后NIHSS评分比较 单位：分

2.2 中医证候评分 与治疗前比较,两组治疗后气虚及血瘀评分均显著降低(P<0.01);治疗后,治疗组较对照组气虚评分更低(P<0.05),两组治疗后血瘀评分比较,差异无统计学意义(P=0.774)。详见表2、表3。

表2 两组治疗前后气虚评分比较(±s) 单位：分

表3 两组治疗前后血瘀评分比较(±s) 单位：分

2.3 临床疗效 根据两组治疗前后NIHSS评分变化评价标准比较两组临床疗效,结果显示,两组均无恶化病人,治疗组总有效率高于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05)。详见表4。

表4 两组临床疗效比较

2.4 脑梗死恢复期气虚血瘀证与健康对照组血清代谢组学比较

2.4.1 PCA PCA可明显区分健康者和脑梗死恢复期气虚血瘀证病人(干预前)的血清代谢组整体差异,详见图1。

图1 不同性别脑梗死恢复期气虚血瘀证病人与健康人PCA得分图(A为男性,粉色表示脑梗死恢复期气虚血瘀证男性病人,绿色表示健康男性;B为女性,绿色表示脑梗死恢复期气虚血瘀证女性病人,粉色表示健康女性)

2.4.2 差异分层聚类分析 不同性别组间差异血清代谢组聚类分析见图2。图中水平轴和垂直轴分别代表样本与变量信息;颜色深浅反映变量值大小,红色表示含量升高,绿色表示含量降低,颜色越深表明变化量越大。

图2 不同性别脑梗死恢复期气虚血瘀证病人与健康人血清代谢组差异分层聚类热图(A为男性,红色表示脑梗死恢复期气虚血瘀证男性病人,绿色表示健康男性;B为女性,绿色表示脑梗死恢复期气虚血瘀证女性病人,红色表示健康女性)

2.4.3 代谢产物差异变化 基于VIP>1.0和ANOVA过滤P<0.05,筛选出健康受试者与脑梗死恢复期气虚血瘀证受试者的差异代谢产物。

男性：共发现46个差异代谢产物,与健康人(J)相比,脑梗死恢复期气虚血瘀证病人(A)有34个代谢物质的血清含量水平上升,12个代谢物质水平下降;水平上升的代谢物质有磷脂酰胆碱(PC)(16：1(9Z)/22：5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))、PC(18：0/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(16：1(9Z)/20：3(8Z,11Z,14Z))、PC(18：2(9Z,12Z)/P-18：1(9Z))、PC(16：1(9Z)/22：2(13Z,16Z))、PC(o-18：1(9Z)/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(14：0/22：5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))、PC(18：3(6Z,9Z,12Z)/16：0)、PC(18：1(9Z)/20：4(5Z,8Z,11Z,14Z))、PC(o-16：1(9Z)/18：2(9Z,12Z))、PC(20：3(5Z,8Z,11Z)/20：3(5Z,8Z,11Z))、PC(o-18：0/22：6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))、PC(o-16：1(9Z)/18：0)、鞘磷脂(SM)(d18：1/22：0)、SM(d18：0/24：1(15Z))、SM(d18：1/24：0)、SM(d18：1/22：1(13Z))、SM(d17：1/24：0)、SM(d16：1/24：1(15Z))、SM(d18：0/22：0)、SM(d18：1/20：0)、溶血磷脂酰胆碱(LysoPC)(18：1(11Z))、LysoPC(20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、LysoPC(16：1(9Z))、LysoPC(17：0)、乳酸、L-缬氨酸、植物鞘氨醇、L-脯氨酸、L-亮氨酸、油酸、D-葡萄糖、L-乙酰肉碱、肌醇;水平下降的代谢物质有全赖氨酸、组胺、硬脂酸、烟酰胺、棕榈酸、瓜氨酸、脱氢表雄酮、3-羟基-3-甲基-2-氧代丁酸、维生素C、PC(O-16：0/18：2(9Z,12Z))、3-氨基丁酸、丙酰肉碱。详见表5。

女性：共发现51个差异性代谢产物,与健康人(J)相比,脑梗死恢复期气虚血瘀证病人(X)有33个代谢物质的血清含量水平上升,18个代谢物质水平下降。水平上升的代谢物质有PC(18：0/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(14：0/22：5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))、PC(20：3(5Z,8Z,11Z)/20：3(5Z,8Z,11Z))、PC(16：1(9Z)/22：2(13Z,16Z))、PC(14：0/18：1(9Z))、PC(18：1(9Z)/20：4(5Z,8Z,11Z,14Z))、SM(d18：0/18：1(11Z))、SM(d18：1/14：0)、SM(d18：1/18：0)、SM(d18：1/18：1(11Z))、SM(d18：0/18：0)、LysoPC(20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、油酸、L-乙酰肉碱、亚油酸、瓜氨酸、棕榈酸、花生四烯酸、2-羟基丁酸、二十二碳六烯酸、十六烷酮、癸酰肉碱、烟酰胺、组胺、L-缬氨酸、二十二碳五烯酸、9-癸酰胆碱、L-辛烷基肉碱、N-(3-氧代碘癸酰基)-L-高丝氨酸内脂、3-羟基-3-甲基-2-氧代丁酸、硬脂酸、亚油酰肉碱、丙烯酰肉碱;水平下降的代谢物质有PC(18：2(9Z,12Z)/P-18：1(9Z))、PC(O-16：1(9Z)/18：2(9Z,12Z))、PC(O-18：1(9Z)/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(O-18：1(9Z)/18：2(9Z,12Z))、PC(O-18：0/18：2(9Z,12Z))、PC(O-18：0/22：6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))、SM(d18：1/22：0)、SM(d18：0/24：1(15Z))、SM(d18：1/22：1(13Z))、SM(d16：1/24：1(15Z))、SM(d18：1/24：0)、溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPE)(0：0/18：2(9Z,12Z))、LysoPE(0：0/18：1(9Z))、左旋肉碱、脱氢表雄酮、鹅去氧胆酸甘氨酸偶联物、肌酸、景天庚酮糖。详见表6。

综合不同性别的组间差异血清代谢产物,脑梗死恢复期气虚血瘀证病人与健康人相比,男性和女性血清代谢产物共同升高的有PC(18：0/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(16：1(9Z)/22：2(13Z,16Z))、PC(14：0/22：5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))、PC(18：1(9Z)/20：4(5Z,8Z,11Z,14Z))、PC(20：3(5Z,8Z,11Z)/20：3(5Z,8Z,11Z))、油酸、L-乙酰肉碱、L-缬氨酸,下降的有脱氢表雄酮。

表5 男性内源性物质变化(VIP>1.0)

表6 女性内源性物质变化(VIP>1.0)

2.4.4 涉及的代谢通路 利用MetaboAnalyst 4.0软件分析VIP>1.0的具有差异的内源性代谢产物,选择P>0.1为影响代谢物质改变的主要代谢通路。男性脑梗死恢复期气虚血瘀证病人代谢物质改变涉及的代谢通路有6条,分别是淀粉与蔗糖代谢、精氨酸生物合成、烟酸和烟酰胺代谢、组氨酸代谢、磷酸肌醇代谢、甘油磷脂代谢,详见表7。女性脑梗死恢复期气虚血瘀证病人代谢物质改变涉及的代谢通路有6条,分别是亚油酸代谢、花生四烯酸代谢、精氨酸生物合成、烟酸和烟酰胺代谢,组氨酸代谢和甘油磷脂代谢,详见表8。通路分析见图3。横坐标Pathway Impact代表通路的重要性值,纵坐标-log(P)代表代谢通路分析的显著性水平;代谢通路的Pathway Impact和-log(P)值越大,圆圈越大,代表代谢差异的相关性越强。

表7 男性代谢通路分析结果

表8 女性代谢通路分析结果

图3 不同性别脑梗死恢复期气虚血瘀证病人的重要代谢通路分析图(A为男性;B为女性)

2.5 补阳还五汤治疗脑梗死恢复期气虚血瘀证的血清代谢组学效应

2.5.1 PCA PCA得分图见图4。

图4 补阳还五汤治疗脑梗死恢复期气虚血瘀证前后的PCA得分图(A为男性;B为女性。X1、X2分别代表治疗前后治疗组病人,J代表健康受试者)

2.5.2 差异分层聚类分析 治疗组不同性别用药前后血清代谢组聚类分析见图5。图中水平轴和垂直轴分别代表样本与变量信息。颜色深浅反映变量值大小,红色表示含量升高,蓝色表示含量降低,颜色越深表明变化量越大。

图5 治疗组用药前后差异分层聚类分析热图(A为男性;B为女性。X1、X2分别代表治疗前后治疗组病人,J代表健康受试者)

2.5.3 代谢产物差异变化 经过ANOVA过滤,筛选出VIP>1.0和P<0.05的代谢物。

男性：共发现39个差异代谢产物,与治疗前相比,治疗后有32个代谢物质的血清含量水平上升,7个代谢物质水平下降。水平上升的代谢物质有PC(18：0/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(16：1(9Z)/22：5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))、PC(16：1(9Z)/22：2(13Z,16Z))、PC(18：1(9Z)/20：4(5Z,8Z,11Z,14Z))、PC(18：3(6Z,9Z,12Z)/16：0)、PC(o-18：1(9Z)/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(o-16：1(9Z)/18：0)、PC(14：0/22：1(13Z))、乳酸、SM(d18：1/22：0)、SM(d18：0/24：1(15Z))、SM(d18：1/24：0)、SM(d18：1/22：1(13Z))、SM(d17：1/24：0)、SM(d16：1/24：1(15Z))、SM(d18：1/20：0)、SM(d18：0/22：0)、LysoPC(20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、LysoPC(20：3(5Z,8Z,11Z))、LysoPC(17：0)、LysoPC(P-18：0)、LysoPC(20：2(11Z,14Z))、L-缬氨酸、油酸、烟酰胺、亚油酸、花生四烯酸、L-脯氨酸、L-乙酰肉碱、L-色氨酸、2-羟基丁酸、3-氨基丁酸;下降的物质有瓜氨酸、组胺、3-羟基-3-甲基-2-氧代丁酸、棕榈酸、PC(14：0/22：5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))、PC(o-16：1(9Z)/18：2(9Z,12Z))、丙酰肉碱。详见表9。

女性：共发现37个差异代谢产物,与治疗前相比,治疗后有27个代谢物质的血清含量水平上升,10个代谢物质水平下降。水平上升的代谢物质有PC(18：0/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(18：1(9Z)/20：4(5Z,8Z,11Z,14Z))、PC(o-16：1(9Z)/18：2(9Z,12Z))、PC(18：2(9Z,12Z)/P-18：1(9Z))、PC(14：0/22：0)、SM(d18：0/18：1(11Z))、SM(d18：1/14：0)、SM(d18：1/18：0)、SM(d18：1/18：1(11Z))、SM(d18：0/18：0)、SM(d18：1/16：0)、LysoPC(20：3(5Z,8Z,11Z))、亚油酸、花生四烯酸、癸酰肉碱、脱氢异雄酮硫酸盐、L-辛酰肉碱、9-癸酰肉碱、反式-2-十二烯酰肉碱、顺式-5-十四烯酰肉碱、16-二氢鞘氨醇、二十二碳五烯酸、4-羟基脯氨酸、3,5-十四碳二烯碳鸟嘌呤、十二烷酰肉碱、D-葡萄糖、全赖氨酸;下降的物质有油酸、L-乙酰肉碱、LysoPC(20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(14：0/22：5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))、左旋肉碱、鹅去氧胆酸甘氨酸偶联物、LysoPE(0：0/18：1(9Z))、2-羟基丁酸、二十二碳六烯酸、棕榈酸。详见表10。

综合不同性别的差异血清代谢产物,经补阳还五汤治疗后,脑梗死恢复期气虚血瘀证男性和女性受试者共同升高的血清代谢产物有PC(18：0/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(14：0/22：1(13Z))、PC(18：1(9Z)/20：4(5Z,8Z,11Z,14Z))、PC(o-16：1)、PC(o-18：1)、SM(d18：1)、SM(d18：0)、LysoPC(20：3(5Z,8Z,11Z))、亚油酸、花生四烯酸,下降的物质有棕榈酸。

表9 治疗组男性病人治疗前后代谢物质变化

2.5.4 涉及的代谢通路 治疗组男性治疗前后代谢物质变化涉及的重要代谢通路有7条,分别是亚油酸代谢、花生四烯酸代谢、精氨酸生物合成、鞘磷脂代谢、组氨酸代谢、色氨酸代谢和甘油磷脂代谢。详见表11。治疗组女性治疗前后代谢物质变化涉及的重要代谢通路有5条,分别是亚油酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、花生四烯酸代谢、鞘磷脂代谢和甘油磷脂代谢。详见表12。重要通路分析图见图6。横坐标Pathway Impact代表的是通路的重要性值,纵坐标-log(P)代表代谢通路分析的显著性水平;代谢通路的Pathway Impact和-log(P)值越大,圆圈越大,代表代谢差异的相关性越高。

表11 治疗组男性病人治疗前后涉及的代谢通路

表12 治疗组女性病人治疗前后涉及的代谢通路

图6 治疗组不同性别病人治疗后涉及的重要代谢通路分析图(A为男性;B为女性)

2.6 安全性指标 治疗过程中,两组血、尿常规,肝肾功能及心电图检查均未见明显异常,且均未发现与服药有关的不良反应。

3 讨 论

补阳还五汤出自清代医家王清任的《医林改错》,是治疗中风病气虚血瘀证的经典方剂。本研究结果表明,补阳还五汤治疗脑梗死恢复期方面宏观疗效确切,尤其在改善气虚证候方面较安慰剂疗效更显著。为进一步探索机制,研究采用LC-MS/MS的分析方法,筛选出与脑梗死恢复期气虚血瘀证相关及应用补阳还五汤治疗前后的病人血清代谢产物,发现变化主要与能量代谢、磷脂代谢、脂肪酸代谢和氨基酸代谢过程有关。同时研究通过对比不同性别受试者的代谢物质变化情况,发现某些代谢物质在不同性别中表现出不同的变化趋势,可能与性别密切相关,但相关证据缺乏,尚待进一步研究。本研究提示的重要代谢途径多数集中在磷脂代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢、类固醇类激素代谢等方面,与机体的能量合成、血管内皮炎性损伤反应、动脉粥样硬化形成、神经元修复等过程密切相关。

3.1 磷脂代谢 磷脂主要包括PC、LysoPC、SM、磷脂酰乙醇胺(PE)和LysoPE,这些分子构成细胞膜的主要成分,在调节膜酶活性、胆固醇稳态和信号通路等方面发挥着重要的作用[9]。PC、LysoPC和SM占到了血清磷脂的95%以上,均含有胆碱,是血清中的3种主要磷脂。其中,PC占细胞总磷脂的40%～50%,对脂蛋白膜的结构和功能发挥着重要的作用[10]。磷脂在细胞生长增殖,维持机体新陈代谢,增强机体免疫力等方面发挥着重要作用[11]。某些磷脂可作为心脑血管疾病、癌症、糖尿病、肾病等疾病的潜在标志物。LysoPC是PC经过内皮脂肪酶激活后产生的,具有参与细胞生长和分化的特定受体[12-13],与炎症、动脉粥样硬化、2型糖尿病和肥胖等有关[14]。体外研究和动物模型表明,LysoPC既有促动脉粥样硬化的生物活性,同时也具有抗动脉粥样硬化的生物活性[15-16],不同LysoPC生物活性由酰链长度和饱和度决定,不同种类的LysoPC作用尚未完全揭示。SM是神经酰胺与PC或PE结合后形成的一种磷脂,在神经细胞轴突周围的髓鞘中含量丰富,约18%的血浆磷脂均以SM的形式存在,已证实导致动脉粥样硬化的低密度脂蛋白胆固醇和极低密度脂蛋白胆固醇中均富含SM。体内SM水平与动脉粥样硬化密切相关,有研究显示,动脉粥样硬化病人体内总的SM含量高于无动脉粥样硬化人群[17]。本研究显示,脑梗死恢复期受试者血清中的多种PC、SM、LysoPC较正常人呈升高趋势,少数PC、SM水平下降,表明病人体内存在磷脂代谢改变,发病后发生磷脂代谢变化,可能与动脉粥样硬化导致脑梗死的病理机制相关。

3.2 氨基酸代谢 缬氨酸是一种必需氨基酸,存在于人体中的为L-缬氨酸,Chen等[18]研究显示,L-缬氨酸可增强巨噬细胞的吞噬功能,具有抗感染的潜力,影响炎症的发生与转归。倪宇昕等[19]研究显示,L-缬氨酸可促进巨噬细胞炎性因子的表达。本研究显示脑梗死恢复期受试者血清L-缬氨酸较对照组升高,提示脑梗死恢复期病人机体存在炎症,可能与血管炎性改变密切相关,提示急性脑血管事件的机体炎症状态可持续长达数周至数月,从代谢组学角度阐释了脑梗死恢复期的炎症病理持续过程。

3.3 脂肪酸代谢 油酸是一种单不饱和脂肪酸,是游离脂肪酸的主要成分。正常情况下,游离脂肪酸是三大能源物质代谢过程中的重要组成部分。肝糖原耗尽时,脂肪组织将中性脂肪分解为游离脂肪酸充当能源使用,亦可引起体内游离脂肪酸增加。油酸可保护大脑免受缺血性损伤,油酸在大脑缺血性损伤后积聚可能是对缺血性脑损伤的保护性反应,脑梗死恢复期病人血清油酸水平升高可反映大脑中油酸含量的增加,提示其对损伤大脑的保护作用,但具体机制尚未明确。同时,大量的油酸有助于促进游离脂肪酸的生成,为机体供能提供更多的底物。

棕榈酸是一类常见的饱和脂肪酸,是人体内含量最多的游离脂肪酸,含量过多易引起胆固醇升高、血管内皮损伤、动脉硬化,并导致心脑血管疾病。脑梗死的病理基础为脑组织缺血缺氧坏死,组织缺氧条件下可诱导异常增殖细胞中缺氧诱导因子-1α激活,并抑制棕榈酸的代谢分解,从而导致其大量积累[20],使脂肪酸β氧化障碍,影响了体内能量代谢。补阳还五汤治疗后,血清棕榈酸水平下降,表明补阳还五汤可能通过改善体内缺氧状况促进脑缺血后因低氧导致的棕榈酸β氧化,调节脂肪酸代谢,从而改善体内能量代谢,促进脑梗死恢复期病人的康复。

肉碱可与长链脂肪酸结合形成酰肉碱,从而使长链脂肪酸以酰肉碱形式通过线粒体膜进入线粒体,参与脂肪酸β氧化产生能量[21],是脂肪酸供能的必要物质。血清肉碱(游离肉碱和酰肉碱)可反映机体总肉碱水平,有助于判断机体是否存在脂肪酸氧化障碍和能量代谢异常。L-乙酰肉碱是左旋肉碱的一种活化形式,在大脑、肌肉和精子中含量丰富,能通过血脑屏障,传递脂肪酸进入线粒体,完成脂肪酸β氧化过程,生成三磷酸腺苷(ATP)供能协助能量转移。本研究结果表明,脑梗死恢复期气虚血瘀证病人血清L-乙酰肉碱较健康受试者均有所增加,提示脑梗死恢复期病人体内可能出现了脂肪酸代谢障碍引起能量代谢异常,从而导致肉碱水平代偿性升高。与临床表现出的气虚症状相对应,提示中医的“气虚”状态与机体能量代谢障碍具有潜在的相关性。

3.4 类固醇激素 脱氢表雄酮(DHEA)是一种雄激素,对脑缺血模型具有神经保护作用。已有研究表明,脑卒中急性期出现的认知障碍与体内DHEA浓度下降密切相关[22]。脱氢异雄酮硫酸盐(DHEAS)是DHEA的硫酸化代谢物,DHEA和DHEAS水平下降与神经元功能障碍和变性有关,可能是由于这些类固醇激素可保护中枢神经系统神经元免受有害物质的伤害。另有研究表明,血清DHEA水平与神经系统疾病严重程度呈负相关[23]。本研究结果显示,脑梗死恢复期气虚血瘀证病人血清DHEA水平低于健康人,提示DHEA保护缺血后损伤的神经元的作用有限,易引起脑梗死恢复期病人认知功能的下降,对预测疾病相关的认知能力下降可能具有一定作用。

综上所述,补阳还五汤可一定程度调节脑梗死恢复期气虚血瘀证病人物质代谢水平,降低血清部分饱和脂肪酸(棕榈酸)水平,提高部分不饱和脂肪酸(亚油酸、花生四烯酸)水平,改善部分磷脂代谢(磷脂酰胆碱类、鞘磷脂类)水平,从而发挥抗动脉粥样硬化,保护缺血后受损的神经细胞,改善机体能量代谢,从而促进神经功能恢复的潜在作用。除去目前已知的可被药物影响的磷脂、油酸等代谢物质,本研究结果显示,脑梗死恢复期病人血清L-乙酰肉碱、L-缬氨酸水平升高及DHEA水平降低,因此可能具有作为疾病标志物的潜力,为相关药物的研发提供了新思路。然而,脑缺血后的物质代谢变化复杂,本研究仅初步探索了脑梗死恢复期气虚血瘀证病人的血清代谢组学特征,并初步提示了补阳还五汤干预后的人体代谢水平变化及不同性别间代谢物质变化的复杂性,药物如何通过影响差异代谢物质对疾病发挥治疗作用需进一步探索和验证,今后可进一步扩大样本量,结合血、唾液、尿、便等多重生物学样本进行多组学联合的研究,利用靶向组学和生物示踪技术,期待进一步揭示中医经典方剂治疗本病的作用机制。