鞘翅目昆虫气味结合蛋白研究进展

范广文 桑育黎 石磊 辛跃强 阚佳格 郝延军

摘    要：嗅觉在昆虫行为反应中具有重要作用，气味结合蛋白是昆虫外周嗅觉系统中发挥关键作用的一类功能性蛋白。鞘翅目为昆虫纲中最丰富的类群，数目众多、分布广泛。虽然气味结合蛋白研究起步较晚，但近年来国内外发展尤为迅速，其主要聚焦于气味结合蛋白与气味分子相互作用研究方面。基于此，本文综述了鞘翅目昆虫气味结合蛋白的种类、结构特征、表达分布、生理功能，以及研究方法，并指明了目前存在问题和未来研究方向，以期为揭示昆虫-植物（气味分子等）化学通讯机制和行为控制及开辟新型害虫防控体系提供理论基础。

关键词：鞘翅目；气味结合蛋白；生理功能；新技术

中图分类号：Q966         文献标识码：A            DOI 编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2023.05.010

Abstract： Olfaction plays an important role in the behavioral response of insects. Odorant binding proteins are a class of functional proteins which play a crucial role in the peripheral olfactory system of insects. Coleoptera are the most abundant group in the insecta class， which are numerous and widely distributed. Although the research on odorant binding proteins started relatively late， the research at home and abroad has developed particularly rapidly in recent years， and mainly focused on the interaction between odorant binding proteins and odor molecules. In this review， we summarized the species， structural characteristics， expression distribution， physiological functions and research methods of odorant binding proteins in Coleoptera， and pointed out current problems and future research directions， in order to provide a theoretical basis for exploring the chemical communication mechanism and behavior control between insects and plants （odor molecules， etc.） and developing new pest control systems.

Key words： Coleoptera; odorant binding proteins; physiological function; new technology

嗅觉作为昆虫与外界环境进行信息交流主要方式之一，具有专一性、灵敏性等特点[1]，在昆虫生长、发育、觅食、聚集、繁殖，以及躲避天敌威胁和外界环境不利伤害等行为反应中起着至关重要作用[2]。研究发现，其外周嗅觉系统包含多种功能性蛋白，例如气味结合蛋白（Odorant Binding Proteins，OBPs）[3]、化学感受蛋白（Chemosensory Proteins，CSPs）[4]、气味受体（Odorant Receptors，ORs）[5]、离子受体（Ionotropic Receptors，IRs）[6]、感觉神经元膜蛋白（Sensory Neuron Membrane Proteins，SNMPs）[6]和气味降解酶（Odor Degrading Enzymes，ODEs）[7]等。气味分子等化学信号通过嗅觉感受器进入外周嗅觉系统，进一步转化为电信号进入脑部中枢神经系统进行加工处理，指导昆虫进行相应的行为活动[8]。其中，气味分子与气味结合蛋白特异性识别并结合既是昆虫嗅觉系统中气味分子传导过程的第一步，也是昆虫感受外界环境信息的关键。1981年Vogt等[9]利用同位素标记法，首次在雄性多音天蚕Antheraea polyphemus触角中发现信息素结合蛋白（Pheromone Binding Protein，PBP）以來，气味结合蛋白一直是生物学领域研究热点。近年来，随着基因组学、转录组学、分子生物学，以及生物信息学等一系列学科飞速进步，昆虫气味结合蛋白研究发展尤为迅速。

鞘翅目是昆虫纲中第一大目，下分为原鞘亚目、菌食亚目、肉食亚目、多食亚目四大亚目，现存已超过38万余种，约占全球动物物种1/4[10]。大多数鞘翅目昆虫是农业[11]、林业[12]、渔业[13]等方面世界性害虫，如天牛、金龟子、赤拟谷盗、米象等。由于其种类繁多、分布广泛、食性复杂、繁殖迅速、适应性强，对木材、中药材、小麦、玉米及仓储物等危害严重，会造成巨大的生态破坏和经济损失[14]。因此，明确自然环境中气味分子和昆虫气味结合蛋白相互作用机制，有助于人们开辟环境友好型害虫治理策略，进而为其他害虫防治、资源可持续利用与发展，以及环境保护等方面提供理论指导和参考。本文对近年来鞘翅目昆虫气味结合蛋白种类、结构特征、表达分布、生理功能，以及研究方法等方面进行了总结和综述。

1 OBPs种类

近年来，越来越多昆虫嗅觉感受器中气味结合蛋白被陆续鉴定。研究表明，昆虫OBPs主要有两大分类方式。一方面，根据OBPs氨基酸序列长度，可将 OBPs 分为短链OBPs、中链OBPs、长链OBPs 3类；另一方面，根据OBPs氨基酸序列中Cys数量及特点，通常分为5个亚型，包括Classic OBPs、Plus-C OBPs、Minus-C OBPs、Dimer OBPs、Atypical OBPs（表1）。在鳞翅目昆虫中，根据OBPs氨基酸序列同源性，通常将Classic OBPs分为3个亚家族，包括普通气味结合蛋白（General Odorant Binding Proteins，GOBPs）、性信息素结合蛋白（Pheromone Binding Proteins，PBPs）、触角结合蛋白（Antennal Binding Proteinx，ABPx）。其中，GOBPs又分为GOBPs Ⅰ和GOBPs Ⅱ[15]，ABPx又分为ABPx Ⅰ和ABPx Ⅱ[16]。但在鞘翅目昆虫中，由于Classic OBPs基因种类和基因资源相对匮乏，目前对Classical OBPs进一步分类较为困难。

Duan J等[17]研究发现，白蜡窄吉丁Agrilus plani-pennis AplaGOBP56A氨基酸序列结构属于Minus-C OBPs，但却被归类为GOBPs亚家族。李广伟等[18-19]研究亦发现，光肩星天牛Anoplophora glabripennis AglaOPB1属于Minus-C OBPs；结合AglaOBP12在雌雄虫触角中表达特征、进化聚类关系，以及与气味分子结合特性等，推测其属于Classical OBPs中ABPx亚家族。

2 OBPs结构特征

气味结合蛋白是一类酸性、水溶性小分子球状蛋白，主要存在于昆虫嗅觉感受器淋巴液[20]。其分子量为15～17 KDa，pH5.0左右，等电点大多在4～6之间。昆虫OBPs由120～150个氨基酸组成，N-末端具有一段约20个氨基酸的信号肽[21]。其中，成熟蛋白第40～60位约有20个亲脂性氨基酸，推测此种结构可能与OBPs结合脂溶性气味物质有关[22]。不同于脊柱动物鼻粘液OBPs β-筒状结构，其二级结构主要为α-螺旋[23]。

经典OBPs氨基酸序列包含6个保守半胱氨酸位点，且第2和第3个Cys之间相隔3个氨基酸残基，第5和第6个Cys之间相隔8个氨基酸残基。其中，6个保守半胱氨酸相互交叉形成3对二硫键（Cys1-Cys3、Cys2-Cys5、Cys4-Cys6），对蛋白三维结构起到稳固作用[24]。二硫键的形成导致空间结构灵活度下降，使其不易变性和退化。因此，无论是脊椎动物还是昆虫，OBPs都具有较高的热稳定性。

非经典OBPs氨基酸序列包含多于或少于6个半胱氨酸位点。其中，Plus-C OBPs多于6个半胱氨酸位点[25]；Minus-C OBPs少于6个半胱氨酸位点[26]；Dimer OBPs具有12个半胱氨酸位点，增大了蛋白与配体结合能力[27-28]（表1）。

3 OBPs表达分布

3.1 OBPs表达分布组织差异

起初研究发现，昆虫OBPs仅在触角中特异性表达。后来大量数据表明，除触角以外，昆虫OBPs在头、胸、腹、足、翅、口器等多个部位中均可表达（表2）。研究进一步发现，不同种类OBPs表达分布量各异。Classic OBPs主要在触角中表达，而Minus-C OBPs可在身体多个部位中表达。

Stefan Dippel等[34]发现，赤拟谷盗Tribolium cast-aneum 15种Classic OBPs（OBP0A、OBP4B、OBP4C、OBP4D、OBP4E、OBP4F、OBP6B、OBP6C、OBP6D、OBP6E、OBP6F、OBP6G、OBP7C、OBP8A、OBP8B）在触角和口器中高度表达；3种Classic OBPs（OBP4J、OBP4A、OBP7D）仅在口器中富集；3种非群集性Classic OBPs（OBP5A、OBP6A、OBP7D）在所有組织中均匀表达。此外，Plus-C OBPs（OBP5E）在触角和口器中均有分布，21种Minus-C OBPs在所有组织中均有表达。其中，OBP4G、OBP 4I、OBP 7E主要表达于头部和腿部；OBP3A、OBP7B、OBP7G、OBP7H、OBP7I、OBP7J、OBP10A、OBP10B、OBP10C、OBP10D主要分布于身体内部；OBP7L、OBP9C参与化学感觉过程；OBP7F、OBP7B主要参与昆虫生长发育；但并未在所有组织中检测出OBP2A。同样，类似现象也存在于其他鞘翅目昆虫中，如暗黑鳃金龟Holotrichia parallela[35]和稻象虫Lissorhoptrus oryzophilus[36]。此外，利用原位杂交和免疫组织技术研究嗅觉感器OBPs表达分布特征，发现昆虫OBPs在不同感器表达量也存在差异。如GOBPs主要在对植物挥发物或一般气味敏感的锥型感器中表达[22]，而PBP主要在对信息素敏感的长毛型感器中表达[37]。

3.2 OBPs表达分布年龄差异

张颖[52]利用蛋白印迹分析，发现SzeaOBP1在低龄幼虫、晚龄幼虫、蛹和初羽化成虫阶段表达量高于成虫阶段，而SzeaOBP28表达量在初羽化成虫和雄成虫阶段、蛹和雌成虫阶段、低龄幼虫和晚龄幼虫阶段逐级递减。

3.3 OBPs表达分布性别差异

王宏民等[53]研究发现，绿豆象Callosobruchus chinensis 6个OBPs在成虫触角、头（不含触角）、腹、足、翅部等均表达，但表达量各异。其中，CchiOBP5在绿豆象雌成虫触角和头部（不含触角）中呈现高表达，表达量显著高于腹、足、翅部。与雌成虫恰恰相反，CchiOBP5在绿豆象雄成虫足部中呈现高表达；在头部（不含触角）中表达量次之；在触角中表达量最低。刘盼静等[54]研究亦发现，绿芫菁Lytta caraganae 22个OBPs在成虫触角中表达情况呈现性别偏向性，LcarOBP9在雄成虫触角表达量比雌成虫触角表达量高出约8倍。

3.4 OBPs表达分布种属差异

OBPs在同科不同属昆虫中丰富度也存在显著差异。如在鞘翅目天牛科昆虫中，灭字脊虎天牛觸角中鉴定出24种OBPs[55]、光肩星天牛触角中鉴定出42种OBPs[43]、星天牛触角中鉴定出46种OBPs[44]，且主要表现为Minus-C OBPs基因数量差异性。

4 OBPs生理功能

4.1 感觉性行为调控

气味结合蛋白在昆虫识别外界气味分子过程中起着重要作用。一般认为，气味结合蛋白生理功能为选择性结合气味分子、转运并保护气味分子、降解与清除有害物质，以及保护触角化学感器等[56]。目前，OBPs参与昆虫生理活动和行为反应过程具体机制尚不明确，主要存在3种假说：一是气味结合蛋白与气味分子结合形成复合体，以复合体形式同受体结合[57]；二是气味结合蛋白先与气味分子结合形成复合体，通过淋巴液后解离[58]；三是气味结合蛋白与气味分子结合形成复合体，通过淋巴液并与受体跨膜蛋白结合后解离[59]。无论哪一种机制都认为，气味结合蛋白与气味分子特异性结合增强了脂溶性物质的水溶性，通过感器淋巴液到达神经树突膜受体，产生刺激，最终气味降解酶将气味分子降解，避免持续兴奋，达到保护作用。近年来，大量试验表明，昆虫某些OBPs表达分布于全身多个组织，推测其具有其他非感觉性功能。因此，除了上述主要作用外，还存在着一些潜在的生理功能。

4.2 生长发育行为调制

Stefan Dippel等[34]研究赤拟谷盗Tribolium castan-eum气味结合蛋白组织特异性表达分布，发现TcOBP7F在变态过程中表达，而TcOBP7B主要在胚胎形成和变态过程中呈现高度活性，推测其可能与赤拟谷盗生长发育行为有关。

4.3 防御行为调制

Zhang等[60]研究北艾挥发油对赤拟谷盗Tribolium castaneum杀虫活性，发现赤拟谷盗幼虫OBP等蛋白表达量显著升高，当使用RNAi抑制TcOBP11表达后，致死量显著增加，推测TcOBP11与赤拟谷盗防御行为有关。

4.4 繁殖行为调制

渠成[41]研究异色瓢虫Harmonia axyridis嗅觉相关蛋白功能，发现HaxyOBP4和HaxyOBP9在雄虫触角表达量显著高于雌虫触角，推测可能与雄虫寻找配偶有关；HaxyOBP6、HaxyOBP10、HaxyOBP19在雌虫触角表达量高于雄虫触角，推测可能与雌虫寻找合适的产卵场所有关。

4.5 觅食行为调制

Zhang等[61]研究玉米象鼻虫Sitapholus zeamais 2种OBPs表达特征和生理功能，发现SzeaOBP1可能参与低龄幼虫觅食行为，SzeaOBP28可能参与低龄幼虫和雄性成虫相关生命活动，包括觅食和交配行为。

4.6 寄主选择行为调制

Zhang等[62]研究松墨天牛Monochamus alternatus宿主定位行为分子基础，利用荧光竞争性结合检测，发现MaltOBP1与宿主植物主要活性成分（+）-α-蒎烯、β-蒎烯、β-石竹烯、（+）-柠檬烯和马鞭草烯酮呈现高度亲和性，推测其在松墨天牛寄主选择行为中发挥重要作用。

4.7 解毒代谢行为调制

Gao等[63]研究发现，北艾挥发油主要活性成分丁香酚显著诱导赤拟谷盗Tribolium castaneum TcOBPC12表达，使用RNA干扰后，末龄幼虫死亡率升高，推测TcOBPC12参与丁香酚防御行为调制。组织表达谱表明，TcOBPC12在幼虫表皮、血淋巴和肠中呈现高度表达，在成虫表皮、头部和脂肪体中呈现高度表达。发育表达谱表明，TcOBPC12在卵后期、幼虫前期、幼虫后期及成虫后期表达量高于其他发育阶段。基于以上试验数据，推测TcOBPC12与幼虫吸收降解外源性有毒物质有关。

5 OBPs研究方法

5.1 OBPs获取方法

对于昆虫OBPs获取方法，经典研究方法往往直接从昆虫触角中分离、纯化气味结合蛋白，进而通过X射线衍射法[64]和核磁共振法[65]研究其结构特征和生理功能。由于大多数鞘翅目昆虫触角较小、分离纯化过程繁杂，目前常采用基因克隆、体外表达方式，即首先构建基因序列，利用分子生物学技术克隆获得目的基因，其次在细胞（真核或原核）中诱导表达，最后利用亲和层析法等纯化获得重组蛋白。目前，蛋白体外表达系统主要包括原核（大肠杆菌）表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物表达系统等[66]（表3）。其中，相比于其他3类，采用原核细胞诱导表达更为常见。如张颖[52]通过原核细胞表达获得SzeaOBP1与SzeaOBP40。王超群等[67]亦通过RT-PCR克隆AcorOBP11，将目的基因连入原核表达系统pET28a、重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3），利用IPTG诱导AcorOBP11重组蛋白表达；超声破碎菌体后取上清液过镍柱，利用重组肠激酶切除His标签并再次过镍柱获得纯化产物，为后续蛋白与配体相互作用研究奠定基础。

5.2 OBPs生理功能研究方法

对于昆虫OBPs与配体（气味分子等）互作研究，以往主要采用同位素标记气味物质进行试验，确定其与气味分子结合特性。目前，随着分子生物学和生物信息学等学科发展，昆虫OBPs结合特性研究方法主要包括同源建模[68]、分子对接[68]、荧光竞争性结合[69]、RNA干扰[70]、免疫荧光定位[71]、蛋白点突变[72]、荧光淬灭[73]等。

5.2.1 同源建模 同源建模即利用序列相似则结构相似原理，当两者（未知蛋白与已知蛋白）序列同源性大于30%时，往往具有相似的三级结构，并通过未知蛋白和模板（已知蛋白结构）比对、构建目标蛋白主链结构模型、构建目标蛋白侧链模型及优化目标蛋白结构等步骤实现建模。

5.2.2 分子对接 分子对接即通过Dock、AutoDock或FlexX等网络软件进行配体（气味分子）与蛋白三维结构刚性、半柔性或柔性匹配对接，不断优化配体（气味分子）位置，寻找最佳构象并预测蛋白活性位点及与配体相互作用方式。

5.2.3 荧光竞争性结合 荧光竞争性结合利用气味分子和荧光探针竞争结合OBPs原理，即气味分子与OBPs结合能力越强，荧光强度值下调越大，并通过计算气味分子和OBPs解离常数Ki（，其中[IC50]为OBPs与1-NPN复合物荧光强度降低50%时气味分子浓度；[1-NPN]为游离1-NPN浓度；K1-NPN为OBPs与1-NPN复合体解离常数），确定OBPs与气味分子结合情况，进而推测其潜在的生理功能。解离常数Ki越小，OBPs与气味分子结合能力越强。一般认为，当0 μmol·L-1 50 μmol·L-1时，OBPs与气味分子无结合能力。

目前，常用型探针为1-氨基蒽（1-AMA）[74]、N-苯基-1-萘胺（1-NPN）[75]、8-苯胺-1-萘磺酸（1， 8-ANS）[76]。其中，N-苯基-1-萘胺（NPN）应用更为广泛。由于荧光竞争性结合具有操作简便、安全性高、价格低等特点，现被广泛应用于分析OBPs与目标配体结合能力。同时，荧光竞争性结合也存在一些不足，如探针专属性不强、OBPs与探针结合后，目的蛋白空间结构、理化性质及动力学参数发生改变等。但处于种种考虑，该方法仍普遍应用于研究OBPs生理功能。

5.2.4 RNA干扰 RNA干扰（RNAi），即双链RNA（dsDNA）诱发生物体内同源mRNA高效降解，可导致昆虫特异性OBPs（靶基因）转录后沉默，广泛应用于昆虫抗药性防御机制研究[77]。目前，人们常常联合行为学试验，如嗅觉行为检测和触角电位技术（EAG）等，验证RNA干扰对OBPs与宿主挥发物（信息素）互作效果，进一步推测其生理功能[78]。

5.2.5 蛋白点突变 蛋白点突变即利用PCR等手段改变目的基因DNA片段，如碱基缺失、添加、突变等，包括定点突变和非定点突变，主要应用于研究蛋白3D结构、预测大分子与小分子相互作用结构位点、提高蛋白稳定性和活性及研发药物等方面。

一般基因突变具有随机性、不定向性、突变频率低等特点。然而，相对于随机突变，通过定点突变技术可按既定计划改造目的基因，獲得相应的氨基酸序列或特定的蛋白质结构，提高选择性和可控性。因此，定点突变技术成为分析蛋白质结构的重要方法。

定点突变技术主要包括寡核苷酸介导定点突变、盒式定点突变、PCR介导定点突变[79]。其中，PCR定点突变技术最为常用，包括重叠延伸PCR、大引物PCR等[80]。通过设计并引入非特异性（错配）碱基引物，获得目标产物。PCR定点突变技术具有以下优点：操作快捷、简便，突变体回收率高，任何位点均可引入突变。

5.2.6 应用 综上所述，同源建模、分子对接、RNA干扰和荧光竞争性结合更广泛应用于研究鞘翅目昆虫OBPs与目标分子结合机制。Li等[81]通过同源建模、分子对接和荧光竞争性结合试验研究花绒坚甲虫Dastarcus helophoroides DhelOBP21与配体结合机制，发现疏水作用和氢键作用在OBPs与配体结合中发挥着重要作用。其中，疏水相互作用比氢键相互作用更重要。Binu Antony等[82]发现，棕榈象鼻虫Rhynchophorus phoenicis RferOBP1768主要负责结合信息素（4-甲基-5-壬醇），并转运至气味受体。当采用RNA干扰RferOBP1768后，结果发现其沉默显著影响了信息素通信作用。Zhou等[69]亦基于同源建模、分子对接和荧光竞争性结合试验，发现TrufOBP4与宿主植物挥发物质对甲氧基肉桂酸辛酯、邻苯二甲酸二丁酯、肉豆蔻酸和棕榈酸具有较高的结合能力。

6 结语与展望

6.1 目前存在问题

研究表明，各类技术在OBPs研究中建树显著，尤其是分析其潜在功能。其中，同源建模、分子对接和荧光竞争性结合联用极为广泛。因此，人们应该充分利用各类技术优势，如李秋玲[83]研究班氏跳小蜂Aenasius bambawalei气味结合蛋白OBPs结合特性，利用同源建模、分子对接技术预测OBPs三维结构；利用荧光竞争性结合筛选高结合性化合物；利用荧光淬灭探究OBPs与配体互作方式、RNA干扰（RNAi）探究OBPs功能；利用圆二色谱分析OBPs与配体互作构象变化。根据上述结论，推测OBPs与气味分子作用机制并初步筛选活性物质。目前，新技术仍是解析OBPs三维结构和推测OBPs生理功能的主要手段。由于种种原因，点饱和突变技术、CRISPR/Cas9基因敲除技术、多光谱技术等新型技术仍未全面应用于阐释OBPs结构和功能。因此，新兴技术应用定将成为研究OBPs重要方向。相信在不远的将来，新技术还会有更大的改进和发展，相互取长补短，为更多人熟悉应用。

鞘翅目昆虫OBPs研究起步较晚。以赤拟谷盗Tribolium castaneum为例，赤拟谷盗为鞘翅目拟步甲科拟步甲属昆虫，广泛分布于我国热带、亚热带、温带地区[84]。作为鞘翅目中一类经典模式昆虫，主要用于研究害虫防治和人类疾病治疗[85-86]。研究发现，昆虫听觉和视觉相对退化、嗅觉系统高度发达[87]。但至今为止，相对于其他模式昆虫，如果蝇、家蚕、蜜蜂等，赤拟谷盗OBPs三维结构未有解析、OBPs组织分布特异性、不同年龄、性别表达差异，以及非感性功能等方面尚未明确。因此，相比于哺乳动物和以鳞翅目为代表的其他类昆虫OBPs研究成果，鞘翅目昆虫OBPs种类、结构特征及表达分布特异性等方面研究有待进一步发展壮大，这或许可为揭示昆虫进化规律提供一定的帮助。另外，其他研究发现，OBPs具有多种多样生理功能。如在昆虫纲中，SiOBP6参与双翅目舌蝇Glossina spp.发育过程中造血系统调制[88]，AfasOBP11参与半翅目三点盲蝽Adelphocoris fasciaticollis味觉感知活动[89]，AccOBP10参与膜翅目中华蜜蜂Apis cerana胁迫条件反应[90]。拓展到哺乳动物，OBPs可能表现为先天免疫体液成分，对致病细菌和真菌具有一定的活性，甚至有望成为抗生素治疗替代剂或辅助剂[91]。借鉴上述结论与技术，在未来工作中，鞘翅目昆虫OBPs 3D结构解析和生理功能等方面研究值得学界全面探索。与此同时，OBPs之间相互拮抗或协同作用关系以及是否以多聚体形式参与气味分子结合亦值得进一步研究。

6.2 未来研究方向

6.2.1 植物源杀虫剂研发 目前，对于害虫防治方法主要采用化学防治。此种方法存在较大弊端，不仅极易使昆虫产生耐药性，而且造成严重的环境污染和生态破坏，难以取得良好的防治效果[92]，甚至危害人体健康。因此，开辟一类新型高效环保的防治措施迫在眉睫。许多研究发现，天然植物提取物（如挥发油）等可通过昆虫外周嗅觉系统，对其生长、发育、觅食、防御、交配、繁殖、信息交流等行为反应产生影响，进而形成驱避[93]、触杀[94]及熏蒸[95]等作用。我国植物资源丰富，许多种类植物具有良好的驱虫、杀虫活性，如楝科、菊科、茄科等。此外，植物精油作为一类新型植物源杀虫剂，具有选择性高、毒性低、挥发性强等特点，在农业生产中前景广阔。但近几年研究发现，鞘翅目昆虫OBPs可能参与防御及解毒代谢行为调制，从而抵御外界有害因素胁迫，产生抗药性，使昆虫存活率上升，但具体作用机制尚不明确。因此，昆虫OBPs与配体结合特性及作用机制仍具有较大研究价值，更好地揭示昆虫与外界环境中气味分子间化学通讯机理，进而为筛选修饰并改造植物挥发油高活性成分、改进单体化合物配伍杀虫方式、增强植物源杀虫剂杀虫活性等方面提供理论基础。

6.2.2 挥发性物质监测 此外，OBPs作为载体蛋白，识别并运输脂溶性气味分子，且热稳定性较高，或许可用于挥发性物质接收和检测工作。若实现此功效，其可在医药、环境、食品等生命科学领域发挥巨大价值。

参考文献：

[1] GADENNE C， BARROZO R B， ANTON S. Plasticity in insect olfaction： to smell or not to smell？[J]. Annual Review of Entomology， 2016， 61： 317-333.

[2] ARCHUNAN G. Odorant binding proteins： a key player in the sense of smell[J]. Bioinformation， 2018， 14（1）： 36-37.

[3] RIHANI K， FERVEUR J F， BRIAND L. The 40-year mystery of insect odorant-binding proteins[J]. Biomolecules， 2021， 11（4）： 509.

[4] PELOSI P， IOVINELLA I， ZHU J， et al. Beyond chemoreception： diverse tasks of soluble olfactory proteins in insects[J]. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society， 2018， 93（1）： 184-200.

[5] WICHER D， MIAZZI F. Functional properties of insect olfactory receptors： ionotropic receptors and odorant receptors[J]. Cell and Tissue Research， 2021， 383（1）： 7-19.

[6] CASSAU S， KRIEGER J. The role of SNMPs in insect olfaction[J]. Cell and Tissue Research， 2021， 383（1）： 21-33.

[7] GODOY R， MACHUCA J， VENTHUR H， et al. An overview of antennal esterases in Lepidoptera[J]. Frontiers in Physiology， 2021， 12： 643281.

[8] CLIFFORD M R， RIFFELL J A. Mixture and odorant processing in the olfactory systems of insects： a comparative perspective[J]. Journal of Comparative Physiology A： Neuroethology， Sensory， Neural， and Behavioral Physiology， 2013， 199（11）： 911-928.

[9] VOGT R G， RIDDIFORD L M. Pheromone binding and inactivation by moth antennae[J]. Nature， 1981， 293（5828）： 161-163.

[10] ZHANG S Q， CHE L H， LI Y， et al. Evolutionary history of Coleoptera revealed by extensive sampling of genes and species[J]. Nature Communications， 2018， 9（1）： 205.

[11] 凌飛. 抗鳞翅目和鞘翅目害虫转基因水稻培育[D]. 武汉： 华中农业大学， 2017.

[12] 傅体美， 孙献荣. 经济林鞘翅目害虫防治技术要点[J]. 乡村科技， 2019（15）： 75-76.

[13] 沈寿昆. 危害鱼苗较为严重的二种鞘翅目昆虫[J]. 动物学杂志， 1959（12）： 575.

[14] RUGMAN-JONES P F， AU M， EBRAHIMI V， et al. One becomes two： second species of the Euwallacea fornicatus （Coleoptera： Curculionidae： Scolytinae） species complex is established on two Hawaiian Islands[J]. PeerJ， 2020， 8： e9987.

[15] ZHANG X Q， YAN Q， LI L L， et al. Different binding properties of two general-odorant binding proteins in Athetis lepigone with sex pheromones， host plant volatiles and insecticides[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2020， 164： 173-182.

[16] VIEIRA F G， ROZAS J. Comparative genomics of the odorant-binding and chemosensory protein gene families across the Arthropoda： origin and evolutionary history of the chemosensory system[J]. Genome Biology and Evolution， 2011， 3： 476-490.

[17] DUAN J， LADD T， DOUCET D， et al. Transcriptome analysis of the emerald ash borer （EAB）， Agrilus planipennis：de novo assembly， functional annotation and comparative analysis[J]. PLoS One， 2015， 10（8）： e0134824.

[18] 李廣伟， 陈秀琳， 尚天翠. 光肩星天牛气味结合蛋白AglaOBP12的基因克隆、表达及配体结合特征[J]. 昆虫学报， 2017， 60（10）： 1141-1154.

[19] 李广伟， 陈秀琳， 尚天翠， 等. 光肩星天牛气味结合蛋白AglaOBP1的克隆、表达及结合特性[J]. 环境昆虫学报， 2017， 39（4）： 919-929.

[20] BRITO N F， OLIVEIRA D S， SANTOS T C， et al. Current and potential biotechnological applications of odorant-binding proteins[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2020， 104（20）： 8631-8648.

[21] PELOSI P， MAIDA R. Odorant-binding proteins in insects[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B： Biochemistry and Molecular Biology， 1995， 111（3）： 503-514.

[22] DU G， NG C S， PRESTWICH G D. Odorant binding by a pheromone binding protein： active site mapping by photoaffinity labeling[J]. Biochemistry， 1994， 33（16）： 4812-4819.

[23] PELOSI P. Odorant-binding proteins： structural aspects[J]. Annals of the New York Academy of Sciences， 1998， 855： 281-293.

[24] TEGONI M， CAMPANACCI V， CAMBILLAU C. Structural aspects of sexual attraction and chemical communication in insects[J]. Trends in Biochemical Sciences， 2004， 29（5）： 257-264.

[25] ZHOU J J， HUANG W S， ZHANG G A， et al. “Plus-C” odorant-binding protein genes in two Drosophila species and the malaria mosquito Anopheles gambiae[J]. Gene， 2004， 327（1）： 117-129.

[26] ZHENG Z C， LI D Z， ZHOU A M， et al. Predicted structure of a minus-C OBP from Batocera horsfieldi（Hope） suggests an intermediate structure in evolution of OBPs[J]. Scientific Reports， 2016， 6： 33981.

[27] WEI H S， DUAN H X， LI K B， et al. The mechanism underlying OBP heterodimer formation and the recognition of odors in Holotrichia oblita Faldermann[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2020， 152： 957-968.

[28] WANG B， GUAN L， ZHONG T， et al. Potential cooperations between odorant-binding proteins of the scarab Beetle Holotrichia oblita Faldermann （Coleoptera： Scarabaeidae）[J]. PLoS One， 2013， 8（12）： e84795.

[29] ANDERSSON M N， GROSSE-WILDE E， KEELING C I， et al. Antennal transcriptome analysis of the chemosensory gene families in the tree killing bark beetles， Ips typographus and Dendroctonus ponderosae （Coleoptera： Curculionidae： Scolytinae）[J]. BMC Genomics， 2013， 14： 198.

[30] TANG Q F， SHEN C， ZHANG Y， et al. Antennal transcriptome analysis of the maize weevil Sitophilus zeamais： identification and tissue expression profiling of candidate odorant-binding protein genes[J]. Archives of Insect Biochemistry and Physiology， 2019， 101（1）： e21542.

[31] 胡軍， 付丽， 张彬， 等. 莲草直胸跳甲气味结合蛋白鉴定及其在触角中的表达分析[J]. 植物保护学报， 2019， 46（4）： 849-859.

[32] TORRES-HUERTA B， SEGURA-LE？譫N O L， ARAG？譫N-MAGADAN M A， et al. Identification and motif analyses of candidate nonreceptor olfactory genes of Dendroctonus adjunctus Blandford （Coleoptera： Curculionidae） from the head transcriptome[J]. Scientific Reports， 2020， 10（1）： 20695.

[33] GONZALEZ F， JOHNY J， WALKER W B 3RD， et al. Antennal transcriptome sequencing and identification of candidate chemoreceptor proteins from an invasive pest， the American palm weevil， Rhynchophorus palmarum[J]. Scientific Reports， 2021， 11（1）： 8334.

[34] DIPPEL S， OBERHOFER G， KAHNT J， et al. Tissue-specific transcriptomics， chromosomal localization， and phylogeny of chemosensory and odorant binding proteins from the red flour beetle Tribolium castaneum reveal subgroup specificities for olfaction or more general functions[J]. BMC Genomics， 2014， 15： 1141.

[35] JU Q， LI X， JIANG X J， et al. Transcriptome and tissue-specific expression analysis of OBP and CSP genes in the dark black chafer[J]. Archives of Insect Biochemistry and Physiology， 2014， 87（4）： 177-200.

[36] YUAN X， JIANG Y D， WANG G Y， et al. Odorant-binding proteins and chemosensory proteins from an invasive pest Lissorhoptrus oryzophilus （Coleoptera： Curculionidae）[J]. Environmental Entomology， 2016， 45（5）： 1276-1286.

[37] VOGT R G， ROGERS M E， FRANCO M D， et al. A comparative study of odorant binding protein genes： differential expression of the PBP1-GOBP2 gene cluster in Manduca sexta （Lepidoptera） and the organization of OBP genes in Drosophila melanogaster （Diptera）[J]. Journal of Experimental Biology， 2002， 205（Pt 6）： 719-744.

[38] WANG Y L， CHEN Q， ZHAO H B， et al. Identification and comparison of candidate olfactory genes in the olfactory and non-olfactory organs of elm pest Ambrostoma quadriimpressum （Coleoptera： Chrysomelidae） based on transcriptome analysis[J]. PLoS One， 2016， 11（1）： e0147144.

[39] LI X M， ZHU X Y， WANG Z Q， et al. Candidate chemosensory genes identified in Colaphellus bowringi by antennal transcriptome analysis[J]. BMC Genomics， 2015， 16： 1028.

[40] LI L， ZHOU Y T， TAN Y， et al. Identification of odorant-binding protein genes in Galeruca daurica （Coleoptera： Chrysomelidae） and analysis of their expression profiles[J]. Bulletin of Entomological Research， 2017， 107（4）： 550-561.

[41] 渠成. 异色瓢虫嗅觉相关蛋白基因的鉴定及功能研究[D]. 泰安： 山东农业大学， 2021.

[42] BIN S Y， QU M Q， PU X H， et al. Antennal transcriptome and expression analyses of olfactory genes in the sweetpotato weevil Cylas formicarius[J]. Scientific Reports， 2017， 7（1）： 11073.

[43] HU P， WANG J Z， CUI M M， et al. Antennal transcriptome analysis of the Asian longhorned beetle Anoplophora glabripennis[J]. Scientific Reports， 2016， 6（1）： 26652.

[44] WANG J Z， HU P， GAO P， et al. Antennal transcriptome analysis and expression profiles of olfactory genes in Anoplophora chinensis[J]. Scientific Reports， 2017， 7（1）： 15470.

[45] LIU S， RAO X J， LI M Y， et al. Identification of candidate chemosensory genes in the antennal transcriptome of Tenebrio molitor （Coleoptera： Tenebrionidae）[J]. Comparative Biochemistry and Physiology. Part D， Genomics & Proteomics， 2015， 13： 44-51.

[46] GU X C， ZHANG Y N， KANG K， et al. Antennal transcriptome analysis of odorant reception genes in the red turpentine Beetle （RTB）， Dendroctonus valens[J]. PLoS One， 2015， 10（5）： e0125159.

[47] 陳聪. 香樟齿喙象信息化学物质的活性组分鉴定及其关键气味结合蛋白的功能分析[D]. 南京： 南京林业大学， 2021.

[48] TANG Q F， SHEN C， ZHANG Y， et al. Antennal transcriptome analysis of the maize weevil Sitophilus zeamais： identification and tissue expression profiling of candidate odorant-binding protein genes[J]. Archives of Insect Biochemistry and Physiology， 2019， 101（1）： e21542.

[49] WEN X J， WANG Q， GAO P， et al. Identification and comparison of chemosensory genes in the antennal transcriptomes of Eucryptorrhynchus scrobiculatus and E. brandti fed on Ailanthus altissima[J]. Frontiers in Physiology， 2018， 9： 1652.

[50] ANTONY B， SOFFAN A， JAK？譒E J， et al. Identification of the genes involved in odorant reception and detection in the palm weevil Rhynchophorus ferrugineus， an important quarantine pest， by antennal transcriptome analysis[J]. BMC Genomics， 2016， 17： 69.

[51] 崔晓宁. 苹果小吉丁虫对寄主植物挥发物的行为反应及嗅觉相关基因功能研究[D]. 杨凌： 西北农林科技大学， 2018.

[52] 张颖. 玉米象气味结合蛋白的表达与结合特性分析[D]. 合肥： 安徽农业大学， 2019.

[53] 王宏民， 张静， 张冲， 等. 绿豆象气味结合蛋白基因的克隆及表达分析[J]. 昆虫学报， 2021， 64（8）： 920-928.

[54] 刘盼静， 魏洪义， 郭坤， 等. 绿芫菁成虫触角中气味结合蛋白和化学感受蛋白基因的鉴定和表达分析[J]. 昆虫学报， 2022， 65（8）： 927-936.

[55] 吉帅帅， 庄翔麟， 刘乃勇. 灭字脊虎天牛触角转录组中气味结合蛋白基因的鉴定及表达谱分析[J]. 四川农业大学学报， 2018， 36（2）： 193-202.

[56] STEINBRECHT R A. Odorant-binding proteins： expression and function[J]. Annals of the New York Academy of Sciences， 1998， 855： 323-332.

[57] STEINBRECHT R A. Are odorant-binding proteins involved in odorant discrimination？[J]. Chemical Senses， 1996， 21（6）： 719-727.

[58] VOGT R G. Molecular genetics of moth olfaction： a model for cellular identity and temporal assembly of the nervous system[M]//GOLDSMITH MR， WILKINS AS. Molecular Model Systems in the Lepidoptera. Cambridge： Cambridge University Press， 1995： 341-368.

[59] ROGERS M E， SUN M， LERNER M R， et al. Snmp-1， a novel membrane protein of olfactory neurons of the silk moth Antheraea polyphemus with homology to the CD36 family of membrane proteins[J]. Journal of Biological Chemistry， 1997， 272（23）： 14792-14799.

[60] ZHANG Y C， GAO S S， XUE S， et al. Odorant-binding proteins contribute to the defense of the red flour beetle， Tribolium castaneum， against essential oil of Artemisia vulgaris[J]. Frontiers in Physiology， 2020， 11： 819.

[61] ZHANG Y， SHEN C， XIA D S， et al. Characterization of the expression and functions of two odorant-binding proteins of Sitophilus zeamais Motschulsky （Coleoptera： Curculionoidea）[J]. Insects， 2019， 10（11）： 409.

[62] ZHANG F M， MERCHANT A， ZHAO Z B， et al. Characterization of MaltOBP1， a minus-C odorant-binding protein， from the Japanese pine sawyer beetle， Monochamus alternatus hope （Coleoptera： Cerambycidae）[J]. Frontiers in Physiology， 2020， 11： 212.

[63] GAO S S， LU R X， ZHANG Y L， et al. Odorant binding protein C12 is involved in the defense against eugenol in Tribolium castaneum[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2021， 179： 104968.

[64] GAUBERT A， AMIGUES B， SPINELLI S， et al. Structure of odorant binding proteins and chemosensory proteins determined by X-ray crystallography[J]. Methods in Enzymology， 2020， 642： 151-167.

[65] LEONE S， EMENDATO A， SPADACCINI R， et al. Solution structure of insect CSP and OBPs by NMR[J]. Methods in Enzymology， 2020， 642： 169-192.

[66] 范翠英， 馮利兴， 樊金玲， 等. 重组蛋白表达系统的研究进展[J]. 生物技术， 2012， 22（2）： 76-80.

[67] 秦健辉， 李金桥， 赵旭， 等. 铜绿丽金龟气味结合蛋白AcorOBP11的表达纯化及功能分析[J]. 中国农业科学， 2021， 54（14）： 3017-3028.

[68] LANGESWARAN K， JEYARAMAN J， MARIADASSE R， et al. Insights from the molecular modeling， docking analysis of illicit drugs and bomb compounds with honey bee odorant binding proteins （OBPs）[J]. Bioinformation， 2018， 14（5）： 219-231.

[69] ZHOU X， WANG Z， CUI G C， et al. Binding properties of odorant-binding protein 4 of Tirathaba rufivena to Areca catechu volatiles[J]. Plants， 2022， 11（2）： 167.

[70] ZHANG X Y， ZHU X Q， GU S H， et al. Silencing of odorant binding protein gene AlinOBP4 by RNAi induces declining electrophysiological responses of Adelphocoris lineolatus to six semiochemicals[J]. Insect Science， 2017， 24（5）： 789-797.

[71] ZHANG Q K， LI Z B， CHEN D K， et al. The molecular identification， odor binding characterization， and immunolocalization of odorant-binding proteins in Liriomyza trifolii[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2022， 181： 105016.

[72] LI L L， HUANG J R， XU J W， et al. Ligand-binding properties of odorant-binding protein 6 in Athetis lepigone to sex pheromones and maize volatiles[J]. Pest Management Science， 2022， 78（1）： 52-62.

[73] YI S Y， LI D Z， ZHOU C X， et al. Screening behaviorally active compounds based on fluorescence quenching in combination with binding mechanism analyses of SspOBP7， an odorant binding protein from Sclerodermus sp.[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2018， 107（Part B）： 2667-2678.

[74] CAMPANACCI V， KRIEGER J， BETTE S， et al. Revisiting the specificity of Mamestra brassicae and Antheraea polyphemus pheromone-binding proteins with a fluorescence binding assay[J]. Journal of Biological Chemistry， 2001， 276（23）： 20078-20084.

[75] WANG Q， LIU J T， ZHANG Y J， et al. Coordinative mediation of the response to alarm pheromones by three odorant binding proteins in the green peach aphid Myzus persicae[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology， 2021， 130： 103528.

[76] WOJTASEK H， LEAL W S. Conformational change in the pheromone-binding protein from Bombyx mori induced by pH and by interaction with membranes[J]. Journal of Biological Chemistry， 1999， 274（43）： 30950-30956.

[77] LIN X， JIANG Y， ZHANG L， et al. Effects of insecticides chlorpyrifos， emamectin benzoate and fipronil on Spodoptera litura might be mediated by OBPs and CSPs[J]. Bulletin of Entomological Research， 2018， 108（5）： 658-666.

[78] LI L， ZHANG W B， SHAN Y M， et al. Functional characterization of olfactory proteins involved in chemoreception of Galeruca daurica[J]. Frontiers in Physiology， 2021， 12： 678698.

[79] 申同健. 蛋白质工程中的基因突变方法学[J]. 生物工程进展， 1987（3）： 11-19.

[80] 黄瑾， 卢伟强， 路一萍， 等. 基于快速定點突变技术的药学专业实验设计[J]. 实验室科学， 2021， 24（5）： 10-14， 17.

[81] LI D Z， YU G Q， YI S C， et al. Structure-based analysis of the ligand-binding mechanism for DhelOBP21， a C-minus odorant binding protein， from Dastarcus helophoroides （Fairmaire; Coleoptera： Bothrideridae）[J]. International Journal of Biological Sciences， 2015， 11（11）： 1281-1295.

[82] ANTONY B， JOHNY J， ALDOSARI S A. Silencing the odorant binding protein RferOBP1768 reduces the strong preference of palm weevil for the major aggregation pheromone compound ferrugineol[J]. Frontiers in Physiology， 2018， 9： 252.

[83] 李秋玲. 班氏跳小蜂气味结合蛋白OBPs的结合特性分析[D]. 武汉： 华中农业大学， 2018.

[84] 张涛， 伍祎， 柳丽君， 等. 我国赤拟谷盗地理分布研究[J]. 中国粮油学报， 2018， 33（5）： 70-75.

[85] R？魻SNER J， WELLMEYER B， MERZENDORFER H. Tribolium castaneum： a model for investigating the mode of action of insecticides and mechanisms of resistance[J]. Current Pharmaceutical Design， 2020， 26（29）： 3554-3568.

[86] Tribolium Genome Sequencing Consortium. The genome of the model Beetle and pest Tribolium castaneum[J]. Nature， 2008， 452（7190）： 949-955.

[87] 万新龙， 杜永均. 昆虫嗅觉系统结构与功能研究进展[J]. 昆虫学报， 2015， 58（6）： 688-698.

[88] BENOIT J B， VIGNERON A， BRODERICK N A， et al. Symbiont-induced odorant binding proteins mediate insect host hematopoiesis[J]. eLife， 2017， 6： e19535.

[89] LI Z B， WEI Y， SUN L， et al. Mouthparts enriched odorant binding protein AfasOBP11 plays a role in the gustatory perception of Adelphocoris fasciaticollis[J]. Journal of Insect Physiology， 2019， 117： 103915.

[90] GUO D Z， HAO C H， CUI X P， et al. Molecular and functional characaterization of the novel odorant-binding protein gene AccOBP10 from Apis cerana cerana[J]. The Journal of Biochemistry， 2021， 169（2）： 215-225.

[91] BIANCHI F， FLISI S， CARERI M， et al. Vertebrate odorant binding proteins as antimicrobial humoral components of innate immunity for pathogenic microorganisms[J]. PLoS One， 2019， 14（3）： e0213545.

[92] RODBELL EA， WANNER KW. First report of Alfalfa weevil （Coleoptera： Curculionidae） resistance to lambda-cyhalothrin in Montana[J]. Journal of Economic Entomology， 2021， 114（5）： 2088-2095.

[93] WU Y， GUO S S， HUANG D Y， et al. Contact and repellant activities of zerumbone and its analogues from the essential oil of Zingiber zerumbet （L.） smith against Lasioderma serricorne[J]. Journal of Oleo Science， 2017， 66（4）： 399-405.

[94] ZHANG W J， YANG K， YOU C X， et al. Contact toxicity and repellency of the essential oil from Mentha haplocalyx Briq. against Lasioderma serricorne[J]. Chemistry & Biodiversity， 2015， 12（5）： 832-839.

[95] ZHOU J， ZOU K X， ZHANG W J， et al. Efficacy of compounds isolated from the essential oil of Artemisia lavandulaefolia in control of the cigarette beetle， Lasioderma serricorne[J]. Molecules， 2018， 23（2）： 343.

资金项目：2021年辽宁省普通高等教育本科教学改革研究优质教学资源建设与共享项目；2021年教育部产学合作项目（202102653013）；辽宁大学“大学生创新创业训练计划”项目（202210140003）

作者简介：范广文（2002—），男，辽宁盖州人，主要从事天然药物化学研究。

通讯作者简介：桑育黎（1973—），女，山东莱州人，教授，博士，主要从事中药质量控制及植物源杀虫剂开发与利用研究；

郝延军（1973—），男，辽宁海城人，主任药师，博士，主要从事天然产物分离与活性研究。