黑木耳黑色素的液体发酵培养及提取工艺研究

王小漫 柴新义 于士军 向玉勇 孙星

摘要 为提高黑木耳黑色素的产量，以碱溶酸沉法对黑木耳液体发酵菌丝体中的黑色素进行提取，以黑色素得率为指标，采用单因素试验和正交设计试验，对黑木耳黑色素的液体发酵生产及提取工艺条件进行了研究。结果表明，黑木耳黑色素的最优液体发酵生产工艺条件为起始pH 5.5、25 ℃、培养9 d；最佳提取工艺条件为NaOH浓度2 mol/ L、料液比1∶40、浸提1.5 h。黑木耳黑色素得率可达1.55%。研究结果可为黑木耳工业化液体发酵生产黑色素提供重要的参考。

关键词 黑木耳黑色素；液体发酵；黑色素得率；工艺条件优化

中图分类号 Q939.96   文献标识号 A

文章编号 1007-7731（2023）05-0031-06

Study on Liquid Fermentation Culture and Extraction Technology of Melanin from

Auricularia auriculata

WANG Xiaoman   CHAI Xinyi   YU Shijuan   XIANG Yuyong   SUN Xing

（School of Biology and Food Engineering， Chuzhou University， Chuzhou Anhui 239000）

Abstract In order to improve the yield of Auricularia auricula melanin， the melanin in liquid fermentation mycelium of Auricularia auricula was extracted by alkali solution and acid precipitation. Taking the yield of melanin as the index， the liquid fermentation production and extraction conditions of Auricularia auricula melanin were studied by single factor test and orthogonal design test. The results showed that the optimum liquid fermentation conditions of Auricularia auricula melanin were as follows：initial pH 5.5， 25 ℃ and culture for 9 days; The optimum extraction conditions were NaOH concentration of 2 mol/L，solid-liquid ratio of 1∶40 and extraction for 1.5 h. The yield of melanin from Auricularia auricula can reach 1.55%. The results can provide an important reference for the industrial liquid fermentation of Auricularia auricula to produce melanin.

Keywords Auricularia auricula melanin; liquid fermentation; melanin yield; optimization of process conditions

黑木耳（Auricularia auricula）隸属担子菌亚门（Basidiomycotina）、层菌纲（Hymenomycetes）、木耳目（Auriculariales）、木耳科（Auriculariaceae）、木耳属（Auricularia），在我国云南、东北、河南等多地广泛分布[1]。黑木耳中富含蛋白质、多糖、氨基酸、黑色素、黄酮、多酚等多种生物活性化合物，兼有优良的食用与药用价值[2]。其中，黑色素是黑木耳最主要的活性物质之一，黑木耳子实体呈现黑褐色就是其富含黑色素的缘故[3]。黑色素是一种氨基酸衍生物，是由多羟基酚类或吲哚类物质氧化聚合而成的大分子疏水性生物聚合体[4]。黑木耳黑色素的安全性高，且具有抗辐射、抗氧化、清除自由基与提高免疫力等多方面的生理功能，是极具发展潜力的天然功能性色素[5-9]。黑木耳的传统栽培是采用固体菌种进行接代转接，每一代都需要经过60～90 d的栽培，周期较长，同时由于环境等不可控因素会导致栽培过程中容易出现菌龄不一致、污染率高以及生产效率低下等问题。微生物深层液体发酵生产技术的逐步成熟，因其具有周期短、成本低、便于分离纯化等优势而引起广泛关注[10-11]。已有研究表明，深层液体发酵的黑木耳在营养价值以及生理活性方面并不比传统栽培技术获得的黑木耳低，其中液体发酵的成分含量甚至高于黑木耳子实体中的含量[12-15]。鉴于此，为提高黑木耳黑色素的产量，本研究以碱溶酸沉法对黑木耳液体发酵菌丝体中的黑色素进行提取，以黑色素得率为指标，采用单因素试验和正交设计试验，对黑木耳黑色素的液体发酵生产及提取工艺条件进行了研究，以期为黑木耳黑色素的工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种。本试验使用黑木耳109菌种，购自山东耀胜生物科技有限公司。

1.1.2 试验试剂。PDA培养基（南通凯恒生物科技有限公司）；葡萄糖（天津市汇杭化工有限公司）、酵母膏（杭州百思生物技术有限公司）、MgSO4·7H2O（上海强顺化工有限公司）、KH2PO4（天津市致远化学试剂有限公司）、HCl、NaOH（上海振企化学试剂有限公司）等均为分析纯。

1.1.3 仪器设备。高压蒸汽灭菌锅（BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌锅）；超净工作台（SW-CJ-1BU，苏州新区枫桥净化设备厂）；高速离心机（H2-16K，湖南可成仪器设备有限公司）；摇床（ZD-85A，常州国宇仪器制造有限公司）；培养箱（DNP-9402AE型，上海三发科学仪器有限公司）；干燥箱（DHG-9203A，上海三发科学仪器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化。配置PDA培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然），将培养基与培养皿放入高压蒸汽锅灭菌。灭菌后，在超净工作台制作PDA平板，并使用接种环挑取黑木耳斜面菌种，接种于PDA平板，然后将平板置于28 ℃培养箱中培养10～14 d，冰箱4 ℃保存备用。

1.2.2 液体发酵培养。液体发酵培养基配方[16]：20%葡萄糖，2%酵母膏，0.2% KH2PO4，0.1% MgSO4·7H2O。将上述液体发酵培养基按照40%的装液量分别装于250 mL的锥形瓶中，随后进行高压蒸汽灭菌。灭菌冷却后，于超净工作台无菌条件下用接种环挑取3～4个约1 cm2大小的菌种块，接种于液体发酵培养基中。接种后，为让菌种充分活化，便于菌种萌发，将三角瓶先置于25 ℃恒温培养箱中静置培养1 d。第2 d再置于25 ℃的摇床中以150 r/min振荡培养7 d。

1.2.3 黑木耳液體发酵菌丝体中黑色素的提取。用8层纱布过滤黑木耳液体发酵培养液中的菌丝体，并用蒸馏水反复冲洗过滤2～3次，过滤后的菌丝体置于65 ℃的干燥箱中干燥24 h，取干燥后的菌丝体置于研钵中研磨成颗粒状或者粉状，保存备用。采用碱溶酸沉法进行黑色素的提取[17-18]，其具体操作步骤：①精确称取0.2 g黑木耳菌丝体粉末状样品，加入试管中，按照1∶30的料液比，加入1 mol/L NaOH溶液，搅拌均匀后，置于80 ℃水浴锅中浸提1 h；②使用高速离心机在10 000 r/min的条件下对步骤①的浸提液离心15 min，离心后取上清液置于试管中；③使用1.5 mol/L HCl溶液调节pH至1.5，随后放入水浴锅中浸提12 h；④12 h后，将浸提液7 500 r/min高速离心10 min，保留沉淀弃上清液，此时的沉淀即为黑色素粗品；⑤重复①～④步骤2～3次，使用去离子水对最终沉淀物反复清洗3～4次，收集沉淀物，即为黑色素纯品，干燥后置于-20 ℃保存。

1.2.4 黑色素得率的测定。黑色素的质量采用恒重差值法测定。将培养皿和滤纸提前置于105 ℃干燥箱中，烘干至恒重（±0.000 1 g），称重。将上述提取的黑色素产品倒入已恒重的装有滤纸的培养皿中再次烘干至恒重，称量。前后差值即为黑色素纯品的质量。黑色素得率计算公式：黑色素得率（%）=（黑木耳黑色素纯品质量÷黑木耳菌丝体质量）×100。

1.2.5 黑木耳黑色素液体发酵培养条件的研究。（1）最适起始pH筛选。因为黑木耳生长环境为酸性[19]，所以分别设置起始pH值为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的液体发酵培养基，按照40%的装液量将摇瓶液体发酵培养基分装在250 mL三角瓶中，每个处理3个重复，在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。待灭菌冷却后，无菌条件下分别接入3～4个约1 cm2大小的菌种块。接种后，置于28 ℃恒温培养箱中静止培养1 d，再放入25 ℃的摇床中以150 r/min培养7 d。按照1.2.4中的方法进行黑木耳黑色素得率的测定。

（2）最适温度筛选。使用上述筛选得到的最适pH，按照40%的装液量将液体发酵培养基分装在250 mL的三角瓶中，共计15瓶。在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。待灭菌冷却后，无菌条件下分别接入3～4个约1 cm2大小的菌种块。接种后，置于28 ℃恒温培养箱中静止培养1 d，然后，分别置于17、21、25、29、33℃的培养温度下，以150 r/min培养7 d，每个不同处理3个重复。随后，按照1.2.3和1.2.4中的方法进行黑木耳黑色素得率的测定。

（3）最适培养天数筛选。利用上述筛选得到的最佳培养起始pH配制液体发酵培养基，按照40%的装液量将液体发酵培养基分装在250 mL三角瓶中，共计15瓶。在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。待灭菌冷却后，无菌条件下分别接入3～4个约1 cm2大小的菌种块。接种后，置于28℃恒温培养箱中静止培养1 d，然后以转速150 r/min的摇床分别培养5、7、9、11、13 d，每个处理3个重复。随后，按照1.2.4中的方法进行黑木耳黑色素得率的测定。

1.2.6 黑木耳液体发酵菌丝体中黑色素的提取工艺研究。（1）最适浸提时间筛选。按照1.2.3中方法，获得黑木耳液体发酵菌丝体粉末状样品。在采用碱溶酸沉法进行黑色素的提取时，分别设置浸提时间为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h的不同试验处理，每个处理3个重复，根据1.2.4中的方法，获得不同处理的黑色素得率，通过不同处理之间的差异性分析，获得黑木耳液体发酵菌丝体中黑色素的最佳浸提时间。

（2）浸提最适NaOH浓度筛选。在采用碱溶酸沉法进行黑色素的提取时，设置NaOH浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L的5个不同处理，每个处理3个重复。根据上述试验筛选的最佳浸提时间进行黑木耳液体发酵菌丝体粉末状样品中黑色素的提取，根据1.2.4中的方法，获得不同处理的黑色素得率，通过不同处理之间的差异性分析，获得黑木耳液体发酵菌丝体中黑色素提取时的最佳NaOH浓度。

（3）浸提最适料液比筛选。采用碱溶酸沉法进行黑色素的提取时，料液比分别按照1∶20、1∶25、1∶30、

1∶35、1∶40 5个不同的试验处理进行设置，每个处理3个重复。依据上述试验筛选的最佳浸提时间和NaOH浓度进行黑木耳液体发酵菌丝体粉末状样品中黑色素的提取，根据1.2.4中方法，获得不同处理的黑色素得率，通过不同处理之间的差异性分析，获得黑木耳液体发酵菌丝体中黑色素提取时的最佳料液比。

1.2.7 黑木耳黑色素生产工艺条件的优化研究。为提高黑木耳黑色素的产量，对不同的液体发酵条件对黑木耳黑色素得率的影响进行了研究。在单因素试验结果的基础上进行了正交试验优化研究，选取最优的温度、pH以及培养天数3个因素，每个因素选取3个水平，设计L9（33）的正交试验组，每个组合3个重复。

1.2.8 数据处理。利用Microsoft Excel 2020对各组单因素试验结果进行统计整理以及绘图。利用IBM SPSS Statistics 26的ANOVA功能对试验结果进行方差分析以及显著性分析。

2 结果与分析

2.1 黑木耳黑色素液体发酵培养条件的研究

2.1.1 黑木耳黑色素发酵生产最适起始pH的筛选。由图1可知，黑木耳在pH 5.5的条件下黑色素的得率最高，在pH低于5时黑色素的合成会受到抑制。这和黑木耳的生长环境有关，黑木耳菌丝的生长环境呈微酸性，黑木耳在生长过程分解蛋白质、淀粉以及纤维素等碳源和能源供于自身生长时，所需要的纤维素酶以及其他生长合成所需要的酶在偏酸的条件下活性高，但是酸性过强条件下可能会发生酪氨酸酶结构的异变从而影响黑色素得率。这与侯若琳等人的研究结果较为一致，侯若琳等[20]在采用纤维素酶联合超声提取的方法对黑木耳黑色素进行提取时发现，在pH为5时，黑木耳菌丝获得率较高，因而黑木耳黑色素得率最高。

2.1.2 黑木耳黑色素发酵生产最适培养温度的筛选。由图2可见，温度是考察黑色素培养工艺路线的一个重要指标，在25～33 ℃这个范围内黑色素得率较高，29 ℃时，黑木耳黑色素得率最高，这与黑木耳的生长习性有关，黑木耳是中温性真菌，温度过高或过低都会抑制菌丝体的生长以及其体内酪氨酸酶的活性[21]。但本试验液体发酵过程中，虽然29 ℃下所提取的黑色素含量最高，但其黑色素得率与在25 ℃处理之间差异不显著。所以，从节约能源和降低成本方面考虑，生产中应选择25 ℃作为黑木耳液体发酵生产黑色素的最佳温度。

2.1.3 黑木耳黑色素发酵生产最适培养时间的筛选。图3结果表明，培养天数对结果影响比较显著，在第9 d时提取的黑色素得率最高，低于7 d以及高于11 d时黑色素含量明显下降。这与菌丝的生长规律有关，培养时间过短黑色素未充分合成，时间过长黑色素被分解因此得率较低。张颖等[22]在通过研究刺五加水提液对黑木耳发酵及其胞内多糖的影响时也发现了这个规律，随着黑木耳菌丝体液体发酵时间的延长，菌量不断增加，但在第9 d后，菌丝体干重开始趋于稳定，说明发酵9 d能满足黑木耳菌株菌丝体的充分生长，继续延长发酵时间对菌丝体生长意义不大，因此选择9 d为最适发酵时长。

2.2 黑木耳发酵菌丝体中黑色素的提取工艺研究

2.2.1 黑木耳发酵菌丝体最佳浸提时间的筛选。结果表明（见图4），随着浸提时间的延长，黑色素得率不断增加，1.5 h时达到最高，但当浸提时间继续延长时，黑色素得率却开始下降。究其原因可能是因为黑色素的提取分离需要一定的时间，时间过短提取不充分，时间过长黑色素可能发生解离，且随着浸提时间的延长，提取液的浓度和料液比发生变化，对黑色素的提取效果也会造成影响[5]，因此最佳浸提时间为1.5 h。

2.2.2 黑木耳发酵菌丝体中黑色素提取的最佳浸提NaOH浓度的筛选。鉴于碱溶液对黑色素选择性高，溶解力强，提取率高，所以本试验采用碱溶的方法对黑色素进行溶解分离，结果表明（图5），NaOH浓度在2 mol/L时，提取效果最好。超过这个浓度，黑色素得率呈现明显下降的趋势，这是由于碱性过强会造成黑色素等活性物质的结构破坏，而碱性过低时无法充分溶解菌丝体中的黑色素，因此都会导致黑色素的得率降低。综上所述，选择2 mol/L作为黑木耳液体发酵菌丝体中黑色素提取的最佳NaOH浓度。

2.2.3 黑木耳发酵菌丝体中黑色素提取的最佳料液比筛选。由图6可知，在1∶20～1∶40的料液比范围内，随着料液比的增加，黑色素的得率不断上升，这是由于随着料液比的比例不断增加，体系中NaOH的占比逐渐升高，对黑色素的析出效果逐渐增强。因此，本试验选用1∶40为最佳提取料液比。

2.3 黑木耳黑色素液体发酵培养条件的优化研究

在上述单因素试验结果的基础上，选取最佳温度、起始pH、培养时间等3个因素，每个因素选取3个水平，设计L9（33）的正交试验组，每个组合3个重复。正交试验设计见表1。

黑木耳黑色素液体发酵的培养条件优化试验结果见表2。结果表明，对黑木耳液体发酵菌丝体中的黑色素得率影响的主次排序为A（pH）>B（培养天数）>C（温度），说明pH对黑色素得率的影响最大，为主要影响因素，温度对黑色素得率的影响最小。3种因素最佳组合为A2B2C1，即pH为5.5，培养天数为9 d、温度为25 ℃，此时的黑木耳黑色素得率可达1.55%。

3 结论与讨论

黑色素作为黑木耳的主要活性成分之一，在其生物功效上发挥着重要作用，如何高效生产和提取黑木耳黑色素对生产应用十分重要。本研究通过单因素试验和正交优化设计试验结果表明，黑木耳黑色素的最优液体发酵生产培养条件为起始pH 5.5、25℃、培养9 d。针对黑色素在碱性溶液中溶解度高，而酸性溶液中溶解度往往较小的原理，我们采用碱溶酸沉法提取黑色素。碱溶酸沉法是黑色素提取中最常用的方法，具有操作简便、效果稳定等优点。研究发现，从黑木耳液体发酵菌丝体中提取黑色素的最佳提取工艺条件为NaOH浓度2 mol/ L、料液比1∶40、浸提1.5 h，黑木耳黑色素得率可达1.55%。

王谦等[23]采用單因子分析和正交实验，对黑木耳深层液体发酵的条件进行了优化研究，并得到了适合液体发酵的最佳条件为pH 5.0，培养温度28 ℃。范心乐等[5]通过对毛木耳的提取工艺优化研究，表明在NaOH浓度为1.5 mol/L时黑色素提取率最高。李琦等[24-26]通过研究黑木耳黑色素的得率影响因素时发现在浸提时间为1.5 h时黑色素得率较高；吴晨霞等[27]通过对木耳黑色素的提取优化发现料液比为1∶40时，黑色素提取率最高，与本研究结果比较一致。目前对于黑木耳黑色素的研究主要集中在生物医药、食品工业以及微生物发酵方面，而对于其提取条件的优化以及成分结构等方面的研究较少[28]。因此，今后应加强黑木耳黑色素的提取优化及结构分析等方面的研究，同时，应加强黑色素应用方面的研究。

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（责编：张 蓓）

基金项目 安徽省科技厅科技成果转移转化乡村振兴科技项目（202107d06020018）；安徽省高等学校本科质量工程项目（2020jyxm1322、2020xsxxkc314）；滁州学院开放实验项目（kfsy2130）。

收稿日期 2022-05-08