环状RNA hsa_circ_0001479在胃癌中的表达及功能研究

施 欣，景蓉蓉，王 洁，刘思楠，崔 明*

1南通大学附属医院检验科，江苏 南通 226001；2南通大学医学院，江苏 南通 226001

胃癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，是全球第四大癌症死亡原因，仅次于肺癌、结直肠癌和肝癌［1］。尽管近年来胃癌发病率有所下降，但由于缺乏有效的早期诊断指标，胃癌患者的治疗效果不佳，预后差，死亡率较高［2-3］。目前，手术治疗是胃癌唯一的根治性治疗方法，放化疗或其他治疗方法常作为辅助治疗手段与手术结合使用［4-5］。因此，对胃癌发生发展的分子机制进行更广泛和深入的研究对寻找新的诊断指标和治疗靶点，改善胃癌患者预后，提高存活率有重要意义。环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类具有闭合环状结构且多不具有蛋白编码能力的RNA［6］。由于具有稳定的环状结构，不易降解，且表达具有组织和疾病特异性，CircRNA有望成为新型肿瘤标志物和治疗靶点的潜力［7］。为探寻新的胃癌差异circRNA，本文结合文献circRNA芯片结果［8］并经实时荧光定量PCR（RT-qPCR）初步验证发现hsa_circ_0001479 可能在胃癌组织中高表达，因此选择该分子进行更深入的研究。本研究首次验证了hsa_circ_0001479 在胃癌组织中表达增高并探究了其对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响，从而初步阐明其在胃癌发生发展中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2017年6月—2020年7月在南通大学附属医院手术的胃癌及配对远端癌旁组织76例（男57例，女19 例），年龄37～82 岁。组织标本一经取出立即置于-80 ℃冰箱保存。所有标本均在放化疗前采集，并经病理确诊。本研究经南通大学附属医院伦理委员会批准。4 株胃癌细胞株（MGC-803、SGC-7901、MKN-45 和BGC-823）及1 株正常胃黏膜上皮细胞株（GES-1）均购自中国科学院上海生命科学研究细胞资源库。

本研究使用的试剂为TRIzol（Invitrogen公司，美国）；逆转录试剂盒（Thermo 公司，美国）；DEPC 水、18s rRNA 引物和ZNF131 引物（上海生工生物工程股份有限公司）；hsa_circ_0001479 引物（广州锐博生物科技有限公司）；SYBR GreenⅠmix（北京百泰克生物技术有限公司）；核糖核酸酶R（Rnase R）（Epicentre 公司，美国）；RPMI 1640 培养基和Matrigel 胶（Corning 公司，美国）；Lonsera 特级胎牛血清（上海双洳生物科技有限公司）；siNC、hsa_circ_0001479 siRNA 和GP-transfect-Mate 转染试剂（上海吉玛制药技术有限公司）；空载体、hsa_circ_0001479 pcDNA（广州吉赛生物科技有限公司）；CCK-8 试剂盒（Dojindo 公司，日本）；Transwell 小室（BD 公司，美国）；细胞周期检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR

根据说明书使用TRIzol试剂从胃癌及癌旁组织或细胞中提取总RNA。用分光光度计测定每个RNA 样本的浓度。参照说明书用逆转录试剂盒将总RNA 反转录成互补DNA（cDNA），反应条件为25 ℃5 min，42 ℃1 h，70 ℃5 min，4 ℃保存。在Light Cycler 480 PCR 仪（Roche 公司，美国）上使用SYBR Green Ⅰmix 通过RT-qPCR 检测circRNA 的表达量，反应条件为95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共45 个循环。以18s rRNA 作为内参，hsa_circ_0001479 的引物序列为F：5′-ATCTTCGAAAACATACAGAGCAGC-3′和R：5′-AACTCCTGAAGGCATTCCATC-3′；18s rRNA的引物序列为F：5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′和R：5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′；ZNF131 的引物为F：5′-ACACGTGTGCAAACTGAACC-3′和R：5′-CCTGGAGCAGATCTGGATGG-3′。用2-ΔΔCt法对目的分子和内参分子进行相对定量分析。

1.2.2 RT-qPCR方法学性能评价实验

精密度评价：依据EP15-A2 文件制定的定量检测方法精密度性能评价标准，选用6 μg组织RNA和3 μg细胞RNA逆转录得到的高低2个浓度的cDNA作为实验样本，每天检测1个批次，2份样本，每份样本重复测定4次，连续检测5 d。

正确度评价：收集目的分子的RT-qPCR 产物50 μL 并送测序公司进行测序，得到的测序结果与Circbase 数据库提供的分子序列进行比对，观察碱基顺序是否一致，扩增片段中是否包含环化位点；将目的分子与内参分子的RT-qPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察产物片段大小与预期是否一致。

线性范围评价：将细胞RNA逆转录得到的cDNA以10 倍倍比稀释，设立5～7 个浓度梯度，通过RTqPCR 检测线性范围，用GraphPad Prism 7 软件进行线性回归分析并作图。

1.2.3 转染与细胞增殖、迁移和侵袭能力检测

转染：将MKN-45、BGC-823和SGC-7901细胞株分别培养于6 孔板中，分为对照组和干扰或过表达组，使用GP-transfect-Mate 转染试剂将siNC 和hsa_circ_0001479 siRNA 转染至MKN-45、BGC-823细胞株，空载体和hsa_circ_0001479 pcDNA 转染至SGC-7901 细胞株。转染48 h 后通过RT-qPCR 测定转染后表达。

细胞增殖能力检测：①CCK-8实验：取转染48 h后的细胞接种于96 孔板中，每组设立4 个复孔，按说明书操作后，用酶标仪上测定450 nm处各孔的吸光度值，连续检测5 d并绘制折线图；②克隆形成实验：取转染48 h 后的细胞以每孔1 000 个细胞接种于6 孔板中，培养2 周后出现肉眼可见的细胞克隆斑，用甲醛固定30 min，结晶紫染色15 min，PBS 洗涤、晾干后拍照并计数。

细胞周期检测：取转染48 h 后的细胞，按试剂盒说明书操作后通过流式细胞仪检测。

细胞迁移和侵袭能力检测：①细胞划痕实验：细胞转染48 h后，在各孔中央用100 μL枪头十字划线，用PBS 洗涤后加入培养基，放入培养箱，分别在培养的第0 h、12 h及24 h在显微镜下拍照。②Transwell 实验：取转染48 h 后的细胞，以50 000 个/室接种于Transwell 小室的上室中（侵袭实验需预先铺一层Matrigel 胶），在下室（24 孔扳）中加入600 μL 含20%胎牛血清的完培，培养48 h 后取出，经PBS 洗涤，甲醛固定30 min，结晶紫染色15 min，PBS洗涤、晾干后在显微镜下拍照并计数。

1.3 统计学方法

用GraphPad Prism 7和SPSS 20.0软件分析实验数据并绘制统计图。采用t检验分析两组数据的组间差异性；采用卡方检验分析hsa_circ_0001479 表达水平与临床病理参数的关系；采用单因素方差分析（one-way ANOVA）分析多组数据的组间差异性；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-qPCR检测hsa_circ_0001479的方法学性能评价

精密度评价：连续5 d通过RT-qPCR检测2份不同浓度的cDNA 标本，结果发现RT-qPCR 检测目的分子hsa_circ_0001479和内参分子18s rRNA均有良好的批内和批间精密度（表1）。

表1 RT-qPCR检测hsa_circ_0001479和18s rRNA的精密度评价Table 1 Precision evaluation for detection of hsa_circ_0001479 and 18s rRNA via RT-qPCR（%）

正确度评价：采用RT-qPCR 检测胃癌组织中hsa_circ_0001479的表达，发现目的分子和内参分子熔解曲线呈单峰，说明扩增产物的特异性良好（图1A）。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果发现目的分子和内参分子的条带单一，片段大小与预期相符（图1B）。收集扩增产物进行桑格测序，测序结果见图1C，将其与Circbase数据库中hsa_circ_0001479的序列进行比对，比对结果100%一致。

图1 RT-qPCR检测hsa_circ_0001479和18 s rRNA的正确度评价Figure 1 Accuracy evaluation for detection of hsa_circ_0001479 and 18 s rRNA via RT-qPCR

线性范围评价：通过RT-qPCR 检测5～7个浓度梯度的样本中hsa_circ_0001479 和18 s rRNA 的CT值，统计分析结果显示，hsa_circ_0001479 线性方程为Y=-2.831X+23.65，r2=0.999 4；18 s rRNA 的线性方程为Y=-2.918X+6.958，r2=0.999 2，该定量检测方法线性良好（图2）。

图2 RT-qPCR检测hsa_circ_0001479（A）和18 s rRNA（B）的线性范围评价Figure 2 Linear range evaluation for detection of hsa_circ_0001479（A）and 18 s rRNA（B）via RT-qPCR

2.2 Hsa_circ_0001479成环性和稳定性验证

Hsa_circ_0001479 的分子结构示意图来源于CSCD数据库（图3A）。其环化位点的位置见测序结果图上的箭头标示（图3B）。通过RT-qPCR 检测发现，RNase R 处理后hsa_circ_0001479 的来源基因ZNF131 的mRNA 表达水平显著下降，而hsa_circ_0001479 的表达水平仅略有下降（图3C），说明hsa_circ_0001479具有较好的稳定性。此外，以cDNA和gDNA 为模板扩增hsa_circ_0001479 和ZNF131，琼脂糖凝胶电泳结果显示，ZNF131 可以在cDNA 和gDNA 中被扩增，而hsa_circ_0001479 只能在cDNA中被扩增（图3D）。以上实验证明了hsa_circ_0001479为结构稳定的闭合环状RNA。

图3 Hsa_circ_0001479的成环性和稳定性验证Figure 3 Ring structure and stability of hsa_circ_0001479

2.3 Hsa_circ_0001479在胃癌组织中的表达及其与临床病理参数的关系

RT-qPCR 结果显示，hsa_circ_0001479 在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织（P＜0.000 1，图4）。结合患者的病理资料，分析hsa_circ_0001479表达水平与各临床病理参数之间的关系，χ2检验分析结果显示，hsa_circ_0001479 表达水平与肿瘤大小（P=0.039）、浸润深度（P=0.044）、淋巴结转移（P=0.011）、TNM 分期（P=0.021）和CA19-9（P=0.042）有关（表2）；以上结果提示胃癌组织中高表达hsa_circ_0001479可能参与胃癌的恶性进展。

图4 hsa_circ_0001479在胃癌及癌旁组织的表达水平Figure 4 Level of hsa_circ_0001479 in 76 GC and paired paracancerous tissues

表2 Hsa_circ_0001479表达水平与临床病理参数的关系Table 2 Relationship between hsa_circ_0001479 expression and clinicopathological factors

2.4 Hsa_circ_0001479 在胃癌细胞株中的表达、定位及转染效率检测

RT-qPCR 结果显示，与GES-1 相比，hsa_circ_0001479 在4 株胃癌细胞株中的表达增高，其中，在MKN-45、BGC-823 细胞株中表达增高较为显著（P＜0.05）。选用MKN-45 细胞株进行核浆分离操作，通过RT-qPCR 检测发现hsa_circ_0001479 主要定位于细胞质中（图5）。选取表达较高的MKN-45、BGC-823 进行干扰实验，表达较低且细胞大小适中的SGC-7901进行过表达实验。

图5 胃癌细胞株hsa_circ_0001479表达水平（A）及核浆分布情况（B）Figure 5 Level of hsa_circ_0001479 in GC cell lines（A）and distribution of hsa_circ_0001479 in GC cells（B）

在转染干扰片段si1 和si2 后检测hsa_circ_0001479表达水平发现，si2片段干扰效率达60%以上，而si1片段几乎无干扰效果，选si2片段进行后续实验（图6A，B）。转染pcDNA hsa_circ_0001479后，胃癌细胞株中hsa_circ_0001479 表达量显著增高（图6C）。

图6 RT-qPCR检测转染后hsa_circ_0001479的表达水平Figure 6 Expression of hsa_circ_0001479 in GC cells after transfection

2.5 Hsa_circ_0001479 对胃癌细胞生物学行为的影响

CCK-8 实验结果显示，与对照组相比，转染hsa_circ_0001479 干扰片段的胃癌细胞增殖能力减弱（图7A，B），转染hsa_circ_0001479 过表达载体的胃癌细胞增殖能力显著增加（图7C）；克隆形成实验结果显示，与对照组相比，转染hsa_circ_0001479干扰片段的胃癌细胞克隆斑数量明显减少（BGC-823：P=0.017，MKN-45：P=0.027，图8A），转染hsa_circ_0001479过表达载体的胃癌细胞克隆斑数量明显增加（P=0.038，图8B），以上实验结果表明hsa_circ_0001479可促进胃癌细胞增殖。

图7 CCK-8法检测hsa_circ_0001479对胃癌细胞增殖能力的影响Figure 7 Detection of the effect of hsa_circ_0001479 on the proliferation of GC cells via CCK-8 assay

图8 克隆形成实验检测hsa_circ_0001479的对胃癌细胞增殖能力的影响Figure 8 The evaluation of the function of hsa_circ_0001479 on proliferation of GC cells via colony formation assay

流式细胞仪检测细胞周期结果显示，与对照组相比，转染hsa_circ_0001479干扰片段的胃癌细胞S期所占比例下降，细胞周期阻滞于G1期（图9A），转染hsa_circ_0001479 过表达载体的胃癌细胞S 期所占比例上升（图9B），说明hsa_circ_0001479 具有加速细胞DNA的复制，促进胃癌细胞由G1期向S期转变，从而增强细胞增殖能力的作用。

图9 流式细胞仪检测hsa_circ_0001479对胃癌细胞周期分布的影响Figure 9 The dection of the function of hsa_circ_0001479 on cell cycle distribution via flow cytometry analysis

划痕实验结果显示，与对照组相比，转染hsa_circ_0001479 干扰片段的胃癌细胞横向迁移距离减少（图10A），转染hsa_circ_0001479过表达载体的胃癌细胞横向迁移距离增加（图10B），Transwell实验结果显示，与对照组相比，转染hsa_circ_0001479干扰片段的胃癌细胞迁移和侵袭能力下降（图11A、12A），转染hsa_circ_0001479 过表达载体的胃癌细胞迁移和侵袭能力增强（图11B、图12B），以上实验结果表明hsa_circ_0001479 可促进胃癌细胞的迁移和侵袭。

图10 划痕法检测hsa_circ_0001479对胃癌细胞迁移能力的影响（×100）Figure 10 The evalution of the function of hsa_circ_0001479 on migration ability of GC cells via wound healing assay（×100）

图11 Transwell法检测hsa_circ_0001479对胃癌细胞迁移能力的影响（×100）Figure 11 The evalution of the function of hsa_circ_0001479 on migration ability of GC cells via Transwell assay（×100）

图12 Transwell法检测hsa_circ_0001479对胃癌细胞侵袭能力的影响（×100）Figure 12 The evalution of the function of hsa_circ_0001479 on invasion ability of GC cells via Transwell assay（×100）

综上，hsa_circ_0001479 具有促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的功能。

3 讨论

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是死亡率较高的癌症之一［1］。研究发现，细胞内遗传物质的改变通过细胞周期、DNA 修复、细胞与基质、凋亡、免疫等多个途径促进了肿瘤的发生发展［9］。CircRNA是一种特殊的非编码RNA，由mRNA前体反向剪接而成，曾被认为是由错误剪接形成的副产物，而近年的研究陆续发现它们在疾病的病理过程起到了非常重要的作用［10，11］。在胃癌中，一些表达异常的circRNA 已被证明对胃癌细胞的增殖、侵袭、迁移、周期及凋亡等生物学行为具有一定影响。例如，在最新的一项研究中，circVAPA在胃癌组织中表达上调，在胃癌细胞株中敲减circVAPA 使细胞增殖、侵袭和迁移能力减弱并促进细胞的凋亡［12］。在另一项研究中，hsa_circ_0009172 在胃癌组织和细胞系中表达下调，在细胞实验中，过表达hsa_circ_0009172可抑制胃癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力以及上皮-间质转化过程［13］。

虽然目前研究者们对circRNA的研究已取得了一定进展，但对于circRNA 在胃癌中的研究仍处于初步阶段，大量表达异常和功能未知的胃癌相关circRNA有待发现。本研究结合文献芯片结果选定了hsa_circ_0001479 作为目的分子，对RT-qPCR 检测hsa_circ_0001479 进行了精密度、正确度以及线性范围评价，并通过Rnase R 实验验证了其成环性和稳定性后，通过RT-qPCR检测了76对胃癌及癌旁组织中hsa_circ_0001479 的表达水平，结果显示，hsa_circ_0001479 在胃癌组织中显著高表达且表达水平与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期及CA19-9 水平有关。为了进一步探究hsa_circ_0001479 对胃癌细胞生物学功能的影响，通过RT-qPCR 测定了hsa_circ_0001479 在胃癌细胞株MKN-45、BGC-823、SGC-7901、MGC-803和胃粘膜上皮细胞株GES-1的表达，发现其在4株胃癌细胞株中表达量均高于GES-1，并选择表达丰度较高MKN-45、BGC-823进行干扰试验，丰度较低的SGC-7901进行过表达试验。通过一系列细胞功能实验发现，敲减hsa_circ_0001479 后，细胞增殖能力降低、细胞周期阻滞于G1 期，细胞迁移和侵袭能力降低。过表达hsa_circ_0001479 则呈现出相反的结果，提示hsa_circ_0001479 可促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，本研究还通过RT-qPCR分别检测了细胞核和细胞浆中hsa_circ_0001479 的表达，发现该分子主要分布于胞浆中。总结以往文献发现，circRNA 的作用机制和其细胞亚定位有一定关系，如定位于胞质的circRNA 多含有miRNA 反应元件（MRE），可能通过与mRNA 竞争性结合miRNA，抑制miRNA 表达从而调节细胞功能［14］。因此，在后续研究中，将进一步研究hsa_circ_0001479 促进胃癌恶性进展的分子机制。

综上所述，胃癌组织和细胞中高表达的hsa_circ_0001479 具有促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的功能。