灵芝破壁孢子粉中粗多糖含量测定的不确定度评估及控制

黄柳娟,王红梅,邵 毅

(上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所,上海 201403)

灵芝(Ganoderma lucidum)是多孔菌科真菌赤芝的干燥子实体,在我国具有悠久的药用历史[1],2018年产量达16.77 万t[2]。 孢子粉是灵芝的生殖细胞,其功能活性物质含量显著高于灵芝子实体[3],是深受消费者青睐的功能食品。 灵芝多糖具有抗肿瘤、增强免疫力等生物活性,是灵芝的主要活性成分之一[4-5],且不同破壁方法处理后,孢子粉粗多糖抗氧化活性与多糖质量浓度呈一定效量关系[6]。 因此不论是评价灵芝破壁孢子粉产品的品质质量,还是精准评价孢子粉粗多糖的营养功效,都需要对其进行准确测量。

目前,食品和农产品中粗多糖的检测还没有国家标准方法,食用菌行业一般采用《NY∕T 1676—2008食用菌中粗多糖的测定》中规定的苯酚-硫酸比色法进行测定[7]。 测量不确定度用以表征合理的赋予被测量值的分散性,以此来判断测定值的可靠程度[8]。 通过不确定度评定,可以分析出对测量结果产生影响的关键因素。 有研究表明,分光光度法测定粗多糖的过程中,标准曲线的拟合对总不确定度影响最大,其次为重复性测定和分光光度计引入的不确定度[9-13],但关于标准品(葡萄糖)在配制稀释过程中引入的不确定度等因素未被涉及。 本研究根据国家计量技术规范《JJF 1059.1—2012 测量不确定度评定与表示》[14],针对标准NY∕T 1676—2008,对检测过程中引入的不确定度分量进行全面分析,从而为粗多糖检测分析方法的改进和检测质量的控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

灵芝(Ganoderma lucidum)破壁孢子粉。

1.2 试剂与仪器设备

葡萄糖(分析纯,美国Sigma 公司);苯酚[分析纯,阿拉丁试剂(上海)有限公司];浓硫酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);无水乙醇(分析纯,上海泰坦科技股份有限公司)。

UV-5100B 紫外-可见分光光度计(上海元析仪器有限公司);AL204-IC 电子分析天平(德国Mettler Toledo 公司);100—1 000 μL 单道可变量程移液器(德国Eppendorf 公司);Sorvall ST16R 离心机(美国Thermo 公司);1 000 mL 容量瓶和250 mL 单标线容量瓶(A 级,上海申玻仪器公司)。

1.3 粗多糖含量测定方法

依据《NY∕T 1676—2008 食用菌中粗多糖含量的测定》[7]对灵芝破壁孢子粉中的粗多糖进行测定。

1.4 不确定度计算

1.4.1 不确定度来源分析

根据检测方法全过程,分析可能影响检测结果的各操作步骤及相关设备。

1.4.2 不确定度分量计算

电子分析天平、移液器和紫外-可见分光光度计等设备的标准不确定度u(x)按其检定证书标示的扩展不确定度U和包含因子k来计算,公式为;相对不确定度为标准不确定度与该仪器测量数值的比值[14]。

基准物质(标准品)和实验室环境温度影响溶液体积的标准不确定度为被测量可能值区间的半宽度a和包含因子k的比值,公式为,包含因子k采用矩形分布,定值为[14]。

标准曲线拟合引入的不确定度采用线性最小二乘法来评估[16]。

测定方法重复性引入的不确定度由贝塞尔公式来评估[14]。

1.4.3 合成不确定度及分量不确定度贡献排序

用方和根方法计算合成不确定度,并根据各个不确定度分量的数值大小对合成不确定度的贡献进行排序。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源分析

根据NY∕T 1676—2008 中方法[7],粗多糖含量计算的数学模型:

公式(1)中,ω:样品中粗多糖的含量,%;m1:从标准曲线中获得的样品溶液中粗多糖的质量,μg;V1:样品定容体积,mL;V2:吸取样品试样溶液的体积,mL;m2:样品质量,g;0.9:葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数。

灵芝破壁孢子粉的粗多糖含量测定过程中不确定度来源包括:(1)葡萄糖标准溶液配置和稀释过程中引入的不确定度;(2)供试品处理过程中引入的不确定度;(3)标准曲线拟合引入的不确定度;(4)样品间的重复性引入的不确定度;(5)紫外-可见分光光度计的精度引入的不确定度(图1)。

图1 不确定度来源因果图Fig.1 Causality diagram of uncertainty source

2.2 葡萄糖标准溶液引入的不确定度

标准溶液引入的不确定度主要包括葡萄糖标准品纯度P,质量M0,葡萄糖标准溶液的定容体积V0和稀释过程,以及实验室环境温度对水体体积的影响T。

2.2.1 标准品纯度引入的不确定度

试验使用的葡萄糖标准品纯度为99.5%±0.5%,按矩形分布计算(k=),则其标准不确定度为,其相对不确定度为。

2.2.2 标准品称量引入的不确定度

根据粗多糖检测方法,称取100 mg 105 ℃烘干至恒重的葡萄糖,则标准品称量引入的不确定度即电子天平精密度引入的不确定度。 电子天平校准证书显示其扩展不确定度U=0.3 mg(k=2),则标准不确定度为,其相对不确定度为-4。

2.2.3 标准品溶液定容引入的不确定度

粗多糖检测标准规定:葡萄糖称重后,用1 000 mL 容量瓶定容。 由JJG 196—2006[15]查得,该规格的容量瓶的容量允差为±0.40 mL,按三角分布(k=)计算其标准不确定度为u(V0) ==1.633 ×10-1,其相对标准不确定度为。

2.2.4 标准曲线梯度稀释时移液器引入的不确定度

葡萄糖标准曲线绘制时,要求分别吸取0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 和1.0 mL 的标准葡萄糖溶液至玻璃试管中,用蒸馏水补至1.0 mL。 试验使用标称容量为100—1 000 μL 的移液器进行移液操作。 移液器校准证书显示其扩展不确定度U= 2.8 μL(k= 2),则其标准不确定度为u(V2)=。 移取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 和1.0 mL 的葡萄糖标准溶液或水时,相对标准不确定度分别为:

标准曲线梯度稀释时移液器引入的不确定度为:

2.2.5 环境温度变化引入的不确定度

试验环境温度控制在20 ±2 ℃,此时水的膨胀系数为2.1 ×10-4,按矩形分布(k=)计算其标准不-4确定速度为。

2.2.6 标准溶液引入的不确定度合成

将影响标准溶液的各个不确定度分量进行合成,得到标准溶液引入的不确定度urel1。

2.3 供试品引入的不确定度

供试品引入的不确定度主要包括供试品质量M2,供试品溶液的定容V1和移取过程,以及试验环境温度对水体体积的影响等。

2.3.1 供试品称量引入的不确定度

同2.2.2,电子天平的标准不确定度为u(M)=1.500×10-4。 根据标准方法,称取0.500 0 g 灵芝破壁孢子粉作为待测样品,重复称取10 次,平均质量M2为0.500 4 g,则其相对不确定度为urel(M2)=。

2.3.2 供试品溶液定容引入的不确定度

样品前处理后,将待测液全部转移至250 mL 容量瓶中。 A 等品250 mL 容量瓶的容量允差为±0.15 mL[15],按三角分布(k=)计算其标准不确定度为,其相对标准不确定度为:。

2.3.3 供试品溶液移取时移液器引入的不确定度

同2.2.4,移液器的标准不确定度为u(V2)=1.400×10-3。 检测时使用标称容量为100—1 000 μL的移液器移取1 mL 待测样品时,供试品溶液移取中移液器引入的相对标准不确定度为:urel(V2)=。

2.3.4 供试品引入的不确定度合成

将影响供试品的各个不确定度分量进行合成,得到供试品引入的不确定度urel3。

2.4 标准曲线的拟合引入的不确定度

按照粗多糖检测的标准方法,以葡萄糖标准溶液质量浓度C1为横坐标,吸光度检测值A1为纵坐标(表1),求得标准曲线的回归方程y = 0.010 3x +0.006,R2=0.999 8。 利用该方程,求得吸光度的理论值A2= 0.010 3C1+0.006 ,进而计算A1与A2的差值,根据贝塞尔公式计算残差标准偏差SR。 其中,公式中的n 为标准曲线制作时测定的点数,即为6。

按照线性最小二乘法拟合直线的不确定度评估公式,计算标准曲线引入的不确定度。 其中,N为供2试)品;溶为液标的准测品定溶次液数中,标即准为品1 0质;C量x平为均供值试,品即溶4液9.按88回7 归μg方∕m程L(计表算1的),质Cj量为浓第度j平次均测值量,标即准6 0溶.4液0 3中 μ葡g∕萄m L糖(表质量,Aj为第j 次测量对照品溶液吸光度。

表1 葡萄糖标准曲线绘制中的吸光度与标准溶液质量浓度Table 1 Absorbances and concentrations of standard solution in glucose standard curve

2.5 测定方法重复性引入的不确定度

对灵芝破壁孢子粉样品进行10 次粗多糖含量的测定,结果见表2。 用贝塞尔公式,求得灵芝破壁孢子粉粗多糖含量的标准偏差为。 重复性的不确定度为u()==1.390×10-2,相对不确定度为。

表2 灵芝破壁孢子粉的粗多糖含量Table 2 Crude polysaccharide content in broken Ganoderma lucidum spore powder

2.6 紫外-可见分光光度计引入的不确定度

紫外-可见分光光度计引入的不确定度由葡萄糖标准溶液吸光度和供试品溶液吸光度两部分组成。由紫外-可见分光光度计检定证书可知其透射比误差U= 0.3% (k= 2),因此其标准不确定度为。 标准品溶液吸光度平均值A0=0.519(表1),供试品溶液吸光度平均值Ax=0.625(表2),其相对不确定度分别为:

由于相对标准不确定度为上述两个合成,即

2.7 合成不确定度的评估

灵芝破壁孢子粉中粗多糖含量测定的相对不确定度为:

标准不确定度为:

Urel = Urel总×样品粗多糖含量=1.690×10-2×2.71% =0.045 8%

2.8 扩展不确定度的表示

当不确定度分布均匀且置信概率为0.95 时,扩展不确定度的包含因子k=2,其扩展不确定度U =2Urel =2×0.045 8% =0.09%,灵芝破壁孢子粉的粗多糖含量可表示为2.71%±0.09%(k=2)。

2.9 不确定度分量排序

通过比较各分量不确定度的大小,发现最主要的不确定度来源是标准品溶液配制稀释过程中引入,其次为标准曲线拟合引入,然后是重复测量引入(表3)。

表3 灵芝破壁孢子粉的粗多糖含量测定各不确定度Table 3 Components of uncertainty in determination of crude polysaccharide content inbroken Ganoderma lucidum spore powder

3 结论与讨论

通过对一个灵芝破壁孢子粉样品的粗多糖含量检测过程的不确定度进行全面评估,发现标准品溶液配置稀释过程中引入的不确定度所占比例最大(表3),值得关注。 标准品溶液配制过程对不确定度的影响在其他参数的检测方法不确定度评估中得到重视[17-19],但在粗多糖检测不确定度评估研究中还未见报道。 葡萄糖标准曲线绘制时分两步,第一步先配制成标准储备液,再稀释成一系列标准工作溶液,稀释过程中引入的不确定度是该项不确定度来源的主要组成部分。 本试验使用移液器来进行移液操作,而如果使用A 类1 mL 移液管,因其允差为±0.007,按三角分布(包含因子k=)计算其标准不确定度(u),结果为,高于移液器的标准不确定度1.400 ×10-3,即会增加不确定度。 当采用“分别吸取0.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL 和10.0 mL 的标准葡萄糖溶液至玻璃试管中并用蒸馏水补至10.0 mL,再吸取1.0 mL 的试液进行后续的苯酚硫酸显色反应”的操作时,即便使用移液管,也可将此步的不确定度由现有的1.198 ×10-2降至7.810 ×10-3。 由此可见,增加标准工作溶液的配制量,可以有效降低标准曲线配制引进的不确定度,在实际检测中具有较强的操作性。

标准曲线拟合引入的不确定度排名第二,这与此前的研究结果[9-10]有差异。 理论上,选择精密度高的仪器,或增加标准曲线的测定点数,可降低标准曲线拟合引入不确定度,从而提高方法的可靠性。 然而,使用高精密度设备会增加成本,而若将标准曲线的点数增加到7 个或8 个,标准曲线拟合Urel 标曲由原来的9.418 ×10-3降为8.905 ×10-3或7.710 ×10-3,降幅并不显著,在实际操作中可行性不强。

综上,在用苯酚-硫酸分光光度法测定灵芝破壁孢子粉中粗多糖含量时,标准品溶液配制和标准曲线拟合是影响不确定度的主要因素,增加标准工作溶液的配制量可有效降低方法的不确定度,提高方法可靠性。