虾青素的生物合成与产业化应用

苗丽青， 马旭辉， 李素贞， 陈茹梅， 柳小庆

（中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）

虾青素最初是从龙虾中分离出来的一种脂溶性类胡萝卜素[1]，主要存在于多种藻类、微生物、甲壳类动物及海洋鱼类中，在高等植物中鲜有报道[2]。自20世纪80年代中期，随着虾青素抗氧化能力及其他生物活性的发现，虾青素开始逐步地应用于动物饲料、保健食品、化妆品和医疗制剂等产品中。欧盟早已批准虾青素可用作膳食补充剂；美国食品和药物管理局也已批准将虾青素用作动物和鱼类饲料的食物着色剂；我国也允许在食品和饲料添加剂中大量使用虾青素。因此，市场对虾青素的需求量越来越大。

在目前的商业化虾青素供应中，主要是通过化学法合成虾青素，或从天然含有虾青素的雨生红球藻、红发夫酵母、虾蟹甲壳中提取虾青素，然后再进一步加工获得不同用途的产品。保健品和医药制剂中通常利用亲水性递送载体来保障虾青素等活性物质在人体内的有效吸收。当前，大规模生产虾青素的方法都存在一定的限制性因素，导致虾青素供不应求。近年来，随着基因工程技术的发展，陆续报道了富含虾青素的转基因作物，如水稻、番茄、玉米等，给未来工业化生产高质量的虾青素带来了新的可能。

1 虾青素的特性

虾青素，又名虾红素，即3,3’-二羟基-4,4’-二酮基-β,β’-胡萝卜素，分子式为C40H52O4。虾青素分子结构包括1条长共轭的多烯烃链以及两端的六元酮环，端环上的C-3和C-3’为手性中心。根据端环手性碳的构象，虾青素具有左旋（3S,3'S）、右旋（3R,3'R）和内消旋（3R,3'S）3种立体构象（图1）。这些不同构象的虾青素均存在于自然界中，如红发夫酵母中的虾青素为左旋构象的游离形式；南极磷虾中以右旋构象的虾青素酯为主；野生鲑鱼中的虾青素主要是左旋构象的游离形式；雨生红球藻中则是左旋构象的虾青素酯，其中单酯约占80%，双酯约占15%，在3或3’位羟基参与酯化的脂肪酸主要有油酸、反油酸、蓖麻酸和花生酸等。此外，根据虾青素结构中碳碳双键连接基团的不同空间排列方式，虾青素也存在顺反异构体，如果2个基团位于双键的同一侧称为顺式结构（Z），反之则称为反式结构（E）（图1）。其中，全反式结构的虾青素最为稳定，并在自然界中大量存在。

图1 虾青素分子主要的立体异构体和几何异构体Fig. 1 Main stereoisomers and geometric isomers of astaxanthin molecules

2 虾青素的合成代谢途径

虾青素作为酮式类胡萝卜素，仅在细菌、真菌、藻类和少数植物中有完整的合成代谢途径，其中包括被人们所熟知的红发夫酵母[3]和雨生红球藻[4-5]。鲑鱼、龙虾等动物从头合成虾青素的能力较差，一般只能通过食物链在体内富集[6-7]。类胡萝卜素的合成代谢途径大同小异。在开花植物中[8]，以3-磷酸甘油醛和丙酮酸为起始底物经过多步反应生成牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP)；而后两分子GGPP在八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase,PSY)的作用下形成八氢番茄红素，此步骤是类胡萝卜素合成的限速节点；再经氧化形成番茄红素后进行分支，一支在番茄红素环化酶(lycopene epsilon cyclase, LCY-e)的作用下合成叶黄素，另一支则向β-胡萝卜素方向进行，最后形成脱落酸。β-胡萝卜素是细菌、真菌、藻类和少数植物中合成虾青素的前体物质，虾青素与β-胡萝卜素的结构差异在于碳链两端环C3和C3’上的羟基及C4和C4’上的羰基。因此，将β-胡萝卜素合成代谢途径延伸到虾青素过程实际上是在β-胡萝卜素分子两端β-环上的相应位点补充羟基和羰基的过程，但在不同物种中，羟基化和羰基化的方式和途径略有不同，总体上可分为3条途径如图2所示。

图2 β-胡萝卜素合成虾青素的3条途径Fig. 2 Three ways of synthesize astaxanthin from β-carotene

夏侧金盏花是目前报道的唯一可以合成虾青素的高等植物。Cunningham等[9]从夏侧金盏花花瓣cDNA文库中筛选出类似β-胡萝卜素3-羟化酶基因的cDNAs（cbfd1和cbfd2），并将这2个cDNAs转入大肠杆菌中进行基因功能验证，结果表明CBFD1/ CBFD2具有底物专一性，可对未修饰的类胡萝卜素β环的C4和类胡萝卜素4-酮基-β-环的C3进行羟基化修饰，但是不能对未修饰的β环或4-羟基-β环的C3进行羟基化修饰。该团队在2011年进一步验证了这个结果，并确定了另外2 个基因hbfd1、hbfd2编码的 HBFD[2]，能够将4-羟基-β-环上的羟基脱氢形成4-羰基-β-环。夏侧金盏花中以β-胡萝卜素为底物合成虾青素时，先由CBFD对β-胡萝卜素β环的C4羟基化；然后该位点的羟基被HBFD脱氢形成羰基；最后由CBFD在4-羰基-β环的C3位添加羟基，从而生成虾青素。

海洋细菌的虾青素代谢途径似乎更简洁。β-胡萝卜素酮化酶CrtW和β-胡萝卜素羟化酶CrtZ之间既不相互干扰，也不像夏侧金盏花中的酮化酶和羟化酶之间有严格的催化反应先后顺序。

藻类中，雨生红球藻的酮化酶BKT和CrtW的氨基酸序列很相似[10]，但和BKT搭配发挥羟化酶作用的是细胞色素P450还原酶[11]。在酵母中，将β-胡萝卜素转化为虾青素的功能基因尚存争议。因为在β-胡萝卜素转化为虾青素的过程中存在羟化和酮化2个不同的反应，而在这一步的前半过程中仅仅克隆到1个相关基因CrtS。Ojima等[12]将CrtS导入可产β-胡萝卜素的大肠杆菌时检测到中间产物海胆酮，以此提出CrtS有羟化和酮化2种功能的假说。但是Álvarez等[13]将CrtS导入能产β-胡萝卜素的毛霉工程菌时只检测到β-胡萝卜素的羟化产物β-隐黄质和玉米黄质，因此认为β-胡萝卜素转化酶只有羟化的功能。Alcaíno等[14]克隆出另一个基因CrtR，编码细胞色素P450还原酶，研究表明CrtR是CrtS将β-胡萝卜素转变成虾青素所必需的。

3 虾青素的应用

3.1 虾青素在水产和畜牧饲料中的应用

虾青素是天然着色剂，它以不同的构象存在于不同物种中，从而赋予生物独特的颜色，极具代表性的是鲑鱼肉质呈现的红色。这种红色让人们在视觉上感受到愉悦，并习惯以这种鲜艳的颜色象征食物的新鲜度和风味。虾青素能够在鱼类的脂蛋白[15]、肌球蛋白[16]、α-肌动蛋白[17]中积累。因此，为了能够使人工养殖的鲑鱼呈现更鲜艳的色泽，传统饲料中需要额外添加适量虾青素。据评估，在2009年动物饲料和营养品市场的需求分别是3亿和3千万美元，但在2020年分别达到8亿和3亿美元，其中虾青素作为鲑鱼饲料的年需求就有2亿美元（2 500美元·kg-1）[18]。

除水产品以外，虾青素还可用于家禽饲料。在肉鸭饲粮中添加10 mg·kg-1的天然虾青素能使其在肉鸭体内有效沉积，促使活鸭的喙、胫掌呈现天然健康的金黄色，也能够有效抑制肌肉的脂质过氧化反应，提高营养价值[19]。用高虾青素玉米完全代替传统饲料中的玉米来饲喂蛋鸡（图3），所产鸡蛋蛋黄中的虾青素可达12.10~14.15 mg·kg-1，每枚鸡蛋的虾青素含量约为540 µg，可满足人体日常抗氧化保健需求[20]。

图3 高虾青素转基因玉米及其饲喂蛋鸡所产的鸡蛋Fig. 3 Astaxanthin corn and eggs from laying hens

3.2 虾青素在保健食品、化妆品中的应用

虾青素分子中的长共轭多烯烃链能够淬灭单线态氧，并清除自由基，因此虾青素具有极强的抗氧化能力[21]。据报道，虾青素的抗氧化活性比玉米黄素、叶黄素、角黄素和β-胡萝卜素高10倍，比生育酚高100倍[22]。因此，人们认为在食品和护肤品中添加虾青素，能够利用其抗氧化活性达到美白护肤、增强免疫及延缓衰老等功效。截至2022年11月，国内标识含有虾青素成分的注册商品有2 371 474个，其中护肤、美妆类有70 765个；食品45 156个；然而，虾青素类保健品基本均为国外进口产品[23-24]。

3.3 虾青素在医疗药物中的应用

由于虾青素具有强抗氧化作用，因此可作为多靶点药理学制剂。虾青素可通过调节肝脏免疫反应、肝脏炎症和氧化应激来预防性改善非酒精性脂肪性肝炎和肝纤维化[25]。除此之外，Fakhri等[26]认为，虾青素可以防止大部分氧化应激和炎症相关的疾病，包括炎症性疾病、癌症、肥胖、高甘油三酯血症、高胆固醇血症及心血管、胃肠道、肝脏、神经退行性眼科、骨骼、生殖系统疾病和皮肤病。Lignell等[27]也表明,口服含虾青素的药物可明显增强人的肌肉力量和对运动的耐受度。

4 商业化虾青素的主要来源

4.1 化学合成虾青素

利用化学法合成虾青素是商业化虾青素的主要来源。在国内，皮士卿等[28]报道了虾青素的化学合成方法，该方法的合成原料获取容易、反应选择度高、合成收率高。在国外，市场供应的合成虾青素主要来源于德国的巴斯夫公司和瑞士的罗氏公司。这2家公司的合成方法相似，过程复杂且条件严苛[29]，但是成本相对低廉。除此之外，也有利用角黄素来合成虾青素的方法，虽然该法合成的虾青素生物活性更高，但成本高、产率低，且合成过程存在危险性[30]。目前，工业化合成的虾青素大多作为饲料添加剂，用于鲑鱼等水产养殖。

4.2 天然提取法

除化学合成法外，还可以从天然含有虾青素的生物中提取虾青素。现有的提取方法主要是从雨生红球藻、血红裸藻、红发夫酵母、虾蟹甲壳等生物中提取虾青素。虾青素在不同物种中的形态不同，生产中一般需要提取较稳定的全反式构象虾青素。目前在工业化生产中，只能从雨生红球藻中提取全反式构象的天然虾青素，但藻类生长周期长、生物量少，且诱导虾青素积累的逆境胁迫与细胞生物量积累互相矛盾，导致雨生红球藻中虾青素含量为1%~5%[31]。红发夫酵母等菌体虽然繁殖速度快，生物量高，但虾青素含量仅0.4%[31]。从废弃甲壳中提取虾青素的方法成本高、产量低、纯度低，因此也极少被采用。总的来说，现有工业化生产方法或多或少存在着技术难度大、生产成本高、虾青素产量低的问题。然而，在保健品和化妆品等领域需要更高安全性和生物活性的天然虾青素，因此导致这类商品价格高昂。

5 生物合成商业化虾青素的基因工程

关于虾青素生物合成的基因工程研究率先在藻类和微生物中开展，其中红发夫酵母中的虾青素含量达到细胞干重的0.5%左右；雨生红球藻的虾青素含量则可达到细胞干重的4%~5%左右（表1）。然而，这些受体生物自身的生物量较低，且其存储虾青素的机制尚未清楚，因此虾青素产量普遍较低。近些年，许多研究者利用绿色环保的农作物作为生物反应器，通过基因工程技术来实现生物合成虾青素（表1）。这种方法具有成本低、操作性强、产量高、生物量高、耐储存等诸多优点。

表1 主要研究物种中的虾青素含量Table 1 Contents of astaxanthin in main studied species

最初关于转虾青素基因的研究是在模式植物烟草中。将雨生红球藻CrtO基因转入烟草，在其花中首次合成了虾青素[35]；而转入蓝藻CrtO的转基因烟草中在叶片中检测到酮类胡萝卜素，含量为165.00 µg·g-1DW[44]；同时融合表达CrtW和CrtZ的转基因烟草和番茄中积累的虾青素量虽有提升但仍然很少[45]；将来自海洋细菌Brevundimonas sp.strain SD212的CrtW和CrtZ通过叶绿体转化烟草，获得的转基因烟草叶片中虾青素的含量高达5.44 mg·g-1DW[37]；将酮化酶基因BKT和CrtB转入马铃薯后，转基因植株的虾青素积累量达13.90 µg·g-1DW[36]；转BKT基因胡萝卜中虾青素积累量达到 91.60 µg·g-1FW[38]。北京大学陈锋团队向拟南芥和烟草中分别转入不同藻类来源的酮化酶基因BKT后，发现来自莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的CrBKT使转基因植株中虾青素积累量分别最高达到2.07和1.60 mg·g-1DW[39-40]；进一步在番茄中同时表达CrBKT和来自雨生红球藻的羟化酶基因HpBHY，转基因番茄果实中虾青素积累量达16.10 mg·g-1DW[41]。

随后，人们将虾青素的生物合成聚焦到粮食作物上。刘耀光团队[43]在水稻胚乳中成功重构了虾青素的代谢途径。Farré等[42]通过基因枪共转化法获得同时表达短波单胞菌（Brevundimonas sp.strain SD212）Crbkt和BrcrtZ基因的转基因玉米，其籽粒虾青素的积累量达16.77 µg·g-1DW。柳小庆等[20]向玉米中引入虾青素合成通路中的关键酶基因创制了高虾青素玉米种质，其虾青素含量高达47.76~111.82 mg·kg-1DW，是以往转虾青素基因谷物的6倍（图3）。

6 虾青素活性递送系统

虾青素是一种高度不饱和的分子，对高温、光照和氧化等条件异常敏感，因此虾青素极易发生降解，进而降低虾青素产品的生物活性。只有同步提高虾青素在应用体系中的生物利用率和稳定性，才能促进虾青素的工业化生产和商业化应用，并对人体健康发挥有效保障。

递送系统在目前可采纳的策略中具有较强保护性和实用性，包括乳液、纳米粒、脂质体等传统递送体系。Khalid等[46]采用高压均质法和改良卵磷脂、酪蛋白酸钠（sodium caseinate, SC）原料将虾青素进行了“水包油”的纳米乳液化处理；Ribeiro等[47]采用预混膜的乳化方式保护虾青素，但其仍会发生部分降解。目前，脂质体多采用卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱[48]、大豆磷脂酰胆碱[49]等材料，用这些材料包裹虾青素，其口服安全性更高，且可被人体消化吸收。相对于前2种方法，纳米颗粒的保护效果更好，利用率更高。采用多次乳化/溶剂挥发法将虾青素包埋在戊二醛交联的壳聚糖基质中，形成直径在5~50 µm的虾青素微胶囊粉末状产品，这种包埋能够保护虾青素不发生异构化或化学降解[50]。利用DNA/壳聚糖共组装物作为纳米载体，可获得DNA/壳聚糖负载虾青素（astaxanthin-loaded DNA/chitosan, ADC）胶体系统[51]，其虾青素含量高达 65 µg·mL-1。ADC 纳米颗粒可短时间内通过肠上皮细胞的内吞作用被吸收，其活性氧清除效率高达54.3%，是游离虾青素的2倍。采用硬脂酸-壳聚糖偶联物和酪氨酸钠（NaCas）通过离子凝胶法制备的生物聚合纳米颗粒，用其包埋虾青素浓度可高达 140 µmol·L-1[52]。通过氧化右旋糖酐和牛血清白蛋白间原位偶联制备的固体脂质-聚合物杂化纳米粒（solid lipidpolymer hybrid nanoparticles, SLPN）包埋虾青素也能够起到有效保护[53]。

虾青素与多种蛋白体能够发生相互作用，其中具有两亲性的蛋白体适合作为亲脂性物质的亲水性递送载体。当脂肪酸作为蛋白配体时，牛血清白蛋白（bovine albumin, BSA)-虾青素系统[54]能够有效保证虾青素的储存稳定性，同时，体外模拟也表现出亲水传递载体，明显改善了虾青素的生物利用率；若换用除DHA以外的不饱和脂肪酸或长链脂肪酸，则包埋的虾青素稳定性下降，但生物利用率有所提高。因此，要根据实际应用中的具体情况来选择配合蛋白体的脂肪酸。从马铃薯淀粉加工副产物中提取出的马铃薯蛋白（potato proteins，PP）[55]也能与虾青素分子形成纳米颗粒，虽然模拟肠胃消化后只达到80%保留率，但由于原料廉价，能够大幅降低虾青素作为膳食补充剂的成本。对于其他疏水性物质的递送载体，如大豆β-聚球蛋白（β-CG）[56]，未来也有望应用于虾青素的递送。

7 虾青素未来应用的展望

虾青素具备多种生物功能，因此具有庞大的市场需求，但现有的工业化生产和商业化应用中都存在着一定的限制性因素。目前，第一步生产来源的难题可通过转基因技术得以解决，尤其是以玉米、水稻为代表的农作物及以番茄、甘蓝为代表的果蔬等植物可作为生物反应器，来大量积累具有较强生物活性的虾青素。其中，含虾青素的果蔬还能够直接供应市场，提高人们日常饮食中的虾青素含量；而玉米作为粮饲兼用的作物，能同时满足人们的日常膳食需求和相关工业用途的需要。但是，由于这些含虾青素的转基因作物存在转化方式带来的外源基因碎片化和基因分离等问题，同时缺少对相关种质中的虾青素特性的评价标准，导致国内的研究成果无法服务于市场需求。第二步有效利用的难题需要靠合理的应用递送系统，并根据实际应用场景来选择对应不同特点的递送系统。随着疏水活性分子递送系统种类的不断增多，且技术相对成熟，尤其是纳米颗粒技术，可利用多种材料对虾青素进行有效保护和递送。如果将与虾青素具有天然特异性互作的蛋白体引入现有的虾青素转基因作物中，有望在生物反应器内同时积累并包埋虾青素分子，“一步化”实现虾青素的物质提取和递送系统装配。随着市场需求的持续增加，关于虾青素研究也会更加深入，未来一定能更好地实现虾青素资源低成本和高效能的产业化应用。