大蓟生品及炭品中多糖不同提取方法的比较分析

刘智勇,张增弟,马黄璜,张 靓

(1.福建中医药大学附属人民医院中药房,福建 福州 350004;2.福建中医药大学附属人民医院临床药学,福建 福州 350004)

大蓟是一种传统中药,为菊科植物蓟Cirsium japonicum Fisch.ex DC.的干燥地上部分,大蓟炭是大蓟的炮制加工品。大蓟具有凉血止血、祛瘀止痛的作用,还能够起到抗菌、抗病毒、抗发炎、抗癌等作用[1]。该药材化学成分复杂,含有三萜、甾体、挥发油、长链炔醇、黄酮、黄酮苷等化合物。多糖也是其中一种成分,其提取含量的影响因素较多,例如温度、操作、浸润程度、提取方法等等。提取方法主要有水提醇沉法、醇提除杂法、超声辅助法、碱提醇法等等。近年来已有不少关于大蓟中黄铜成分的有关文献报道,但是关于多糖类成分的还不够多[2-4]。为此,本文从本地择取市售大蓟饮片生品共计100个、炭品共计100个当做实验标本,均接受水提醇沉法、醇提除杂法、超声辅助法、碱提醇法进行多糖提取。探索各方法之间的多糖提取含量测定值差异性,详情如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

从本地择取市售大蓟饮片生品共计100个、炭品共计100个当做实验标本。药材:所有药材均采购于福建福州,且被福建中医药大学附属人民医院池志珍副主任药师鉴定过为大蓟和大蓟炭。仪器:产自天津市泰斯特仪器有限公司、型号为FW100的高速万能粉碎机,型号为3100PC的紫外-可见分光光度计,产自国华电器有限公司、型号为HY-4的振荡机,产自昆山超声仪器厂、型号为KQ3200的超声波清洗器,型号为Sartorius BS214-D的天平(1/万),产自国华电器有限公司、型号为HH-2的数显恒温水浴锅,型号为2NHW的电热套,产自浙江上虞道墟张兴纱筛厂的药典筛。试剂:浓度为98%的浓硫酸(分析纯),浓度为4%的苯酚(重蒸、分析纯),纯化水,产自江西省药品检验所、批号为0833-9501的葡萄糖对照品,产自南昌鑫光精细化工厂的氯仿(分析纯),产自天津恒兴化学试剂制造有限公司的无水乙醇(分析纯),产自天津市恒兴化学试剂制造有限公司的正丁醇(分析纯),娃哈哈纯净水。

1.2 方法

所有中药均接受水提醇沉法、醇提除杂法、超声辅助法、碱提醇法进行多糖提取。

1.2.1 水提醇沉法

将大蓟生品、炭品使用中药粉碎机处理为粉末状,并通过三号筛备用。严格的称取各10g、各3份的大蓟生品、炭品置入烧杯中,加入200mL的纯化水进行烧沸、煎煮2h、2次,将滤液合并、浓缩至60mL。再使用20mL的乙醚进行3次脱脂处理,利用sevag法(氯仿-正丁醇为5∶1、样品-试剂为2∶1)进行脱蛋白,振荡8min。以3500r/min的离心速度开展20min的离心处理,进行4次脱蛋白。取出其上清液,加入300mL的无水乙醇,静置一夜时间。待其沉淀后收集起来,加入纯化水进行溶解,转移入100mL的量瓶中,最后用纯化水进行相应刻度的定容、摇匀。

1.2.2 醇提除杂法

严格的称取大蓟生品、炭品各10g、各3份置于500mL圆底烧杯之中,加入200mL浓度为95%的乙醇进行1h的回流处理,并趁热过滤,使用95%乙醇20mL对残渣进行3次洗涤。然后将其与滤纸共同放于圆底烧杯中,加入150mL纯化水,进行30min的水浴加热提取,并趁热过滤,用20mL的纯化水对残渣进行3次洗涤,将洗液合并后,浓缩至60mL。使用20mL乙醚进行3次的脱脂处理,使用sevag法进行脱蛋白,振荡8min。以3500r/min的离心速度开展20min的离心处理,脱蛋白4次。取出其上清液,转移入100mL的量瓶中,使用蒸纯化水进行相应刻度的定容、摇匀。

1.2.3 超声辅助法

严格的称取大蓟生品、炭品各10g、各3份,加入200mL的纯化水进行30min的超声处理后,进行4h的回流处理,并趁热过滤,浓缩至60mL。使用20mL的乙醚进行3次脱脂后,使用sevag法进行脱蛋白,振荡8min。以3500r/min的离心速度开展20min的离心处理,脱蛋白4次。取出其上清液,加入300mL无水乙醇,静置一夜时间,待其沉淀后收集好,使用纯化水进行溶解。之后转移入100mL量瓶中,用纯化水进行相应刻度的定容、摇匀。

1.2.4 碱提醇法

严格的称取大蓟生品、炭品各10g、各3份,加入0.5mol/L的NaOH,200mL,静置一夜时间后进行过滤。在滤液中加入36%乙酸进行中和,得到胶状沉淀。进行溶剂挥干,得到浸膏沉淀,并用纯化水溶解。之后转移至100mL量瓶中,用纯化水进行相应刻度的定容、摇匀。

1.2.5 苯酚-硫酸比色法

①苯酚溶液的配备。精密称取苯酚4.0002g,加入纯化水进行溶解,并转移至100mL的量瓶中,再利用纯化水进行相应刻度的定容、摇匀、超声,最后得到的即为浓度为4%的苯酚溶液。②苯酚-硫酸比色法。从以上各提取方法得到的100mL的待检测溶液中分别取出0.2mL,放置于10mL的量瓶中,加入纯化水进行相应刻度的定容、摇匀。然后再从中取出2.0mL,放置于25mL的具塞试管中,分别精密加入 4% 的苯酚溶液 1 mL,浓硫酸7 mL,摇匀,放置于沸水中加热保温 30 min,取出后放冷,以纯化水为空白,于490 nm波长处测定吸光度(A)。根据线性回归方程 A =0.487C + 0.042 6 (r=0.9945),计算出各待测溶液中的多糖含量,并换算出样品中多糖含量。

1.2.6 对照品溶液的配备

严格称取105℃干燥到恒重的葡萄糖10.00mg,放置于10mL的量瓶中,加入蒸馏水溶解后进行稀释达到相应刻度,摇匀后即为1.00g/L的葡萄糖溶液。然后从中严格量取2mL溶液,加入双蒸馏水并定容于10mL的量瓶之中,即为0.20g/L的对照品溶液。

1.2.7 精密度实验

从上述对照组品溶液中严格吸取0.4mL,共6份,分别置入25mL的具塞试管中。对于体积不够2.0mL的使用蒸馏水进行补充,然后加入4%苯酚溶液1mL、浓硫酸7mL,摇匀后放置于沸水中进行30min的加入处理,取出后放冷,取出,以纯化水为空白,于490nm波长处测定A,计算出RSD0.40%,代表仪器的精密度为良好。

1.2.8 重复性实验

严格称取大蓟生品供试品各10g,各5份,根据醇提除杂法制备方法对供试液进行配备,并按照标准曲线制作下的相同条件进行测定,计算出RSD0.34%,代表本实验的重复性为良好。

1.3 观察指标

多糖提取含量测定值:使用苯酚-硫酸比色法测定各提取方法得到的多糖含量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 多糖提取含量测定值

探索各方法之间的多糖提取含量测定值(表1)差异性,大蓟生品中,含糖量最高的为超声辅助法(t=17.058、26.230、153.894,P=0.000、0.000、0.000),其次为醇提除杂法、水提醇沉法、碱提醇法。大蓟炭品中,含糖量最高的为醇提除杂法(t=2.095、12.444、100.492,P=0.037、0.000、0.000),其次为超声辅助法、水提醇沉法、碱提醇法。使用超声辅助法进行多糖提取时,大蓟生品、炭品得到的含糖量基本相近(t=1.147,P=0.253),使用碱提醇法进行多糖提取时,大蓟炭品得到的含糖量比生品显著更高(t=34.234,P=0.000)。

表1 多糖提取含量测定值

3 讨论

大蓟是一种中药材,在我国各地均有产出。其性凉、味甘、苦,归心、肝经,能够起到凉血止血、散瘀消肿的作用。该药材化学成分十分繁杂,包括有黄酮、生物碱、挥发油、糖类化合物等等。药理作用、临床应用均十分广泛。临床中多用于肺结核、阑尾炎、乳腺炎、急性黄疸性肝炎等疾病的治疗中[5-6]。该植物药用价值极高,已被广大学者选择进行研究,但是对于抗菌、降压等成分的研究还不够深,仅仅停留在提取物层次。在大蓟中,多糖是一种有效成分,近年来已被逐渐发现、应用。已经发现其药理作用为抑菌、清除自由基,能够影响机体抵抗衰老[7-8]。因此,找到对大蓟进行多糖提取的高效方法至关重要。

常见的提取方法有水提醇沉法、醇提除杂法、超声辅助法、碱提醇法等等。水提醇沉法是一种常见的大蓟多糖提取手段,使用设备简易,使用试剂实惠无害,操作也比较简单,提取后得到的多糖含量也较高[9-10]。但是提取物中大概率会含有较多杂质成分,影响多糖测定结果。碱提醇法在大蓟生品、炭品中多糖提取量均不高,因为该方法得到的多糖多为碱溶性、少部分为中性,没有酸溶性多糖。且在进行酸中和时,因为溶液颜色的因素,无法准确判断出胶状沉淀,也会影响多糖提取含量。醇提除杂法指的是使用乙醇提取,将单糖、低聚糖、苷类、生物碱等等干扰成分去除干净,再使用蒸馏水进行多糖成分的提取,最终得到的成分较纯、含糖量较高,进行多糖含量测定时效果较好[11-12]。超声辅助法和醇提除杂法相比,污染性更小,工艺过程也更简单,提取量基本相当。和水提醇沉法相比,提取量更高,使用起来效果比较理想。

基于此,本文从本地择取市售大蓟饮片生品共计100个、炭品共计100个当做实验标本。所有标本均接受水提醇沉法、醇提除杂法、超声辅助法、碱提醇法进行多糖提取。以各方法之间的多糖提取含量测定值差异性展开探析。最终结果为:探索各方法之间的多糖提取含量测定值差异性,大蓟生品中,含糖量最高的为超声辅助法(P<0.05),其次为醇提除杂法、水提醇沉法、碱提醇法。大蓟炭品中,含糖量最高的为醇提除杂法(P<0.05),其次为超声辅助法、水提醇沉法、碱提醇法。使用超声辅助法进行多糖提取时,大蓟生品、炭品得到的含糖量基本相近(P>0.05),使用碱提醇法进行多糖提取时,大蓟炭品得到的含糖量比生品显著更高(P<0.05)。提示,超声辅助法是大蓟生品进行多糖提取的最佳方法、醇提除杂法是大蓟炭品进行多糖提取的最佳方法。且使用超声辅助法进行多糖提取时,大蓟生品、炭品得到的含糖量基本相近,而使用碱提醇法进行多糖提取时,大蓟炭品得到的含糖量比生品显著更高。

探析其原因可能为:对于大蓟生品来说,超声会将其植物细胞壁破坏掉,使多糖更容易被提取出来[13-14]。对于大蓟炭品来说,醇提除杂法能够去除较多杂质,让多糖测定效果更好,得到更高的吸光度,从而得到更高的含糖量。大蓟炭品在炒炭过程中,自身组织结构被破坏,导致细胞多糖中碱溶性多糖更易被提取出,因此得到更高的含糖量[15]。

综上所述,选择超声辅助法对大蓟生品进行多糖提取、选择醇提除杂法对大蓟炭品进行多糖提取,得到的最终样品含糖量较高。