基于网络药理学和分子对接探讨大黄-黄芪药对防治糖尿病肾病的作用机制*

王晓斐,吴深涛

1.天津中医药大学第一附属医院,天津 300381; 2.国家中医针灸临床医学研究中心,天津 300381

糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病常见的微血管并发症之一[1],在我国成年人群中糖尿病患病率已达11.2%[2],其中约20%～40%合并有DKD[3]。DKD发病机制复杂,临床症状及并发症繁多,病程迁延日久,预后不良,已成为慢性肾脏病和终末期肾病的主要病因,严重危害人类健康[4-5]。现代医学针对DKD常需明确病因和病理诊断,早期予降糖、降压等治疗延缓其进展,后期采取透析或肾移植,但都存有一定局限性[6]。中医药防治DKD方法众多,对改善临床症状、减少并发症发生、延缓疾病进展具有重要作用。

中医学中并没有“糖尿病肾病”的明确记录,常依据其临床症状、演变及预后的规律归为“肾消”“尿浊”“水肿”等范畴,现代医家将其中医病名确定为“消渴病肾病”,认为其核心病机为本虚标实,虚者脏腑气血阴阳皆虚,实者气、血、痰、湿、浊、毒等邪气内停机体。据统计,治疗DKD的中药专利复方中大黄与黄芪配伍频次最高[7],大黄、黄芪作为治疗DKD的代表药对被广泛应用于临床实践中,大黄泻下解毒、逐瘀通经,黄芪补气托毒、升阳利水,二者相须为用,疗效显著,且副作用小、安全性高。但中药有效成分多样,作用于人体和防治DKD的机制复杂,仍需进一步探究。网络药理学为研究药物与疾病之间的关联提供方法,可预测中药防治疾病的潜在靶点和机制[8]。故本研究借助网络药理学预测大黄-黄芪药对预防或治疗DKD的成分和靶点,并进行生物信息学分析,为后续分子机制研究及临床应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 大黄-黄芪有效成分及靶点筛选在中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)中检索“大黄”“黄芪”,获知所含主要化合物成分,依据口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和类药性指数(drug-likeness,DL)≥0.18进行筛选,得到其有效成分及其靶点蛋白[9]。通过Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)对靶点蛋白进行标准化处理[10],最后用Excel梳理去重,构建大黄-黄芪的“药物-成分-靶点”数据库。

1.2 DKD疾病基因靶点筛选综合GeneCards(https://www.genecards.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)、在线人类孟德尔遗传数据库(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://omim.org/)[10],检索关键词为“Diabetic kidney disease”,以物种“Homo sapiens”为筛选条件,筛选实验研究验证的与DKD相关的疾病基因,汇总并去重后得到疾病靶点数据库。

1.3 交集靶点筛选及“中药-有效成分-交集靶点-DKD”网络构建利用Venny2.1.0软件将筛选得到的有效成分相关靶点和疾病靶点取交集,并绘制韦恩图。通过Cytoscape3.9.1软件,构建“中药-有效成分-交集靶点-DKD”可视化网络图,并对其进行网络拓扑分析筛选关键成分。

1.4 蛋白质互作网络(protein-protein interaction networks,PPI)构建与核心靶点筛选PPI可将靶点间的相互关系进行可视化,直观表达各靶点在DKD防治中的相互作用。将交集靶点输入String数据库(https://www.string-db.org/),限定物种为“Homo Sapiens”,交互可信度设置为0.7,获取PPI网络关系。利用Cytoscape 3.9.1软件网络拓扑分析插件CytoNCA筛选得到核心靶点。

1.5 基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路富集分析运用R语言软件对交集靶点进行GO富集和KEGG通路富集分析。使用R3.6.3软件安装并引用Biocmanager、clusterProfiler、ggplot2、Pathview等程序包,首先将基因Symbol转化为基因ID,选择物种为人(Homospanies),设定阈值为P≤0.05且Q≤0.05[11],进行GO-生物学过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、细胞组分(cellular component,CC)分析和KEGG信号通路富集分析,并绘制气泡图。

1.6 分子对接利用Atuodock软件对关键成分和核心靶点进行分子对接。从TCMSP数据库中获得主要成分的结构文件,从PubChem(https://pub-chem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库下载核心靶点的三维结构,使用PyMol和Atuodocks软件进行去水、去配体、加氢等预处理后对有效成分和核心靶点蛋白进行对接,以最低结合能作为分子对接的结果,使用PyMOL将对接结果可视化。

2 结果

2.1 大黄-黄芪药对有效成分及作用靶点基于TCMSP检索得到大黄-黄芪药对有效成分27个,其中大黄10个、黄芪17个,见表1。27个有效成分对应225个作用靶点,其中黄芪218个、大黄71个。应用Uniport数据库将靶点标准化处理,去重后得到有效成分作用靶点212个。

表1 大黄-黄芪药对有效成分

2.2 DKD疾病基因靶点筛选基于GeneCards、Drugbank、OMIM数据库,以“Diabetic kidney disease”为检索关键词,获知DKD疾病基因靶点,去重后共计3 513个。

2.3 交集靶点及“中药-有效成分-交集靶点-DKD”网络取212个药物靶点和3513个疾病靶点的交集,并利用 Venny2.1.0工具绘制韦恩图,见图1,得到有效成分靶点与疾病关联靶点的交集靶点156个。利用Cytocsape软件构建“中药-有效成分-交集靶点-DKD”相互关联网络,网络包含186个节点,561条边,见图2,图中菱形代表DKD疾病,圆形代表有效成分,八边形为中药(绿色为大黄,橙色为黄芪),其余为交集靶点。网络图说明大黄-黄芪作用于DKD是多成分、多靶点起效的复杂过程。黄芪中的槲皮素、山柰酚、7-O-甲基异木糖醇、芒柄花素、异鼠李素及大黄中的芦荟大黄素、β-谷甾醇是药物活性成分中度值排名前7位的成分,可能在大黄-黄芪药对防治DKD中起到关键作用。

图1 大黄-黄芪有效成分靶点与DKD交集靶点韦恩图

图2 “中药-有效成分-交集靶点-DKD”网络图

2.4 PPI网络与核心靶点运用String数据库获取交集靶点的PPI网络关系,通过Cytoscape软件初步构建PPI可视化网络图。该PPI网络图包含有147个节点和1 090条边。靶点节点按Degree值排列,Degree值越大,颜色越深,节点越大。根据连接度中心性(Degree)、中介度中心性(betweenness centrality,BC)、紧密度中心性(closeness centrality,CC)值排序筛选大黄-黄芪治疗DKD的核心靶点,得到肿瘤蛋白P53(tumor protein P53,TP53)、蛋白激酶B1(protein kinase B1,AKT1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,CASP3)、丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及IL-1β等,见图3。

表2 核心蛋白拓扑参数

图3 PPI网络

2.5 GO和KEGG富集分析GO分析共富集到 2 752 条生物过程条目,包含生物过程2 512条,涉及对氧化应激、营养水平、脂多糖、细菌源分子、抗生素、金属离子、类固醇激素的反应,细胞对药物、氧化应激的反应,还有活性氧代谢过程等;分子功能168条,主要有蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶、受体配体、DNA结合转录激活剂、内肽酶活性细胞因子、丝氨酸水解酶等活性,细胞因子受体、泛素样蛋白连接酶、泛素蛋白连接酶、磷酸酶等结合以及RNA聚合酶II特异性等;细胞组分72条,主要有膜筏、膜区、囊泡腔、转录因子复合物、神经元细胞体等。分别选取条目前10位进行气泡图的绘制,如图4。KEGG共富集到186条信号通路,按基因富集数排序并绘制前20条通路的气泡图,见图5。交集基因主要富集于5类通路:①人类疾病通路:糖尿病并发症的AGE-RAGE、液体剪切应力和动脉粥样硬化、胰腺癌、内分泌抵抗等通路;②代谢通路:脂质和动脉粥样硬化等通路;③细胞进程通路:细胞衰老、细胞凋亡等通路;④有机体系统通路:IL-17等通路;⑤环境信息处理通路:TNF、MAPK、磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor -1,HIF-1)等信号通路。

图4 GO富集分析

图5 KEGG富集分析

2.6 分子对接将PPI分析得到的部分核心靶点与部分有效成分进行分子对接,获知其结合能,结合能越低,表示结合能力越好,见表3。槲皮素与CASP3、IL-6,山柰酚与AKT1、IL-1β、IL-6,7-O-甲基异木糖醇与AKT1、CASP3、IL-1β、IL-6,β-谷甾醇与AKT1、IL-1β、CASP3、IL-6、TNF,芦荟大黄素与AKT1、IL-1β、CASP3、IL-6、TNF的结合能均<5 kcal·mol-1,具有较好的结合能力。选择分子对接最佳构象将其可视化,见图6。

图6 分子对接模式图

表3 分子对接最低结合能 (kcal·mol-1)

3 讨论

消渴日久及肾,正气虚损,医家对消渴病肾病认识多集中于本虚标实,虚则无法正常代谢运化致毒邪蓄积,且无力抗邪出体外,邪实进一步阻滞气机、戕害人体,如此恶性循环、病无转机。大黄、黄芪为治疗消渴病肾病常用中药,既可单独起效,又具有异源同流、协同增效的作用,是消渴病肾病扶正祛邪、攻补兼施之治疗原则的缩影,两药合用,升降相因,大黄泻浊解毒,黄芪升清纳精,可概括为固利相兼、祛粗取精,泻而祛除糟粕使其无蓄积于体内而戗伐正气,补而纳摄精微使其留存体内而固护正气。动物实验研究证明,大黄、黄芪均具有调节糖脂代谢、抗炎及氧化应激、抗肾脏纤维化等作用,并且两药合用,事半功倍[12]。临床研究证实,含大黄-黄芪药对中药复方可明显改善DKD患者相关指标,延缓疾病向终末期肾病进展,提高患者生存质量[13]。

本研究首先构建了大黄-黄芪药对治疗DKD的调控网络,其27个活性成分与156个DKD疾病靶点密切相关,可见该药对发挥作用具有多成分、多靶点的特点。从“中药-有效成分-交集靶点-DKD”网络图可知,黄芪中的槲皮素、山柰酚及大黄中的芦荟大黄素、β-谷甾醇等药物成分度值排名靠前,提示以上成分可能在大黄-黄芪药对治疗DKD中起关键作用。槲皮素可通过抑制氧化应激和TGF-β1/Smad信号通路,增加足细胞特异性标志物肾素和足细胞特异性标志物的表达,并降低足细胞损伤标志物desmin的表达,改善足细胞损伤[14]。山柰酚可降低肾脏TNF-α和IL-6的表达,通过介导Nrf-2/HO-1轴提高抗氧化能力[15]。芦荟大黄素通过调控IRF4改善糖尿病肾病[16]。β-谷甾醇可改善血糖,调节脂代谢,进一步保护肾脏[17]。

有研究显示,氧化应激和炎症反应在DKD的发生发展中起到重要作用,高血糖使得晚期糖基化终产物的逐步累积,进而肾细胞氧化损伤,细胞凋亡增加,炎症随之发生,肾小球和肾小管的生理功能受损,加速DKD进程[18]。GO分析中也可见生物学过程富集于对氧化应激的反应上。KEGG 富集结果显示,大黄-黄芪药对有效成分可能通过糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、MAPK、PI3K-AKT、HIF-1等信号通路发挥作用。AGE受体(RAGE)与其配体的结合可激活不同的细胞内信号通路,如PI3K/AKT、MAPK/ERK和NF-κB,促使大量炎症因子(如 IL-6、VEGFA、TNF-α等)表达和释放,引起肾组织中的氧化应激和慢性炎症,最终导致肾功能丧失[19]。HIF-1α升高可增加结缔组织生长因子CCN2的表达,进一步诱发炎症及肾脏纤维化[20]。

PPI网络分析显示,TP53、AKT1、TNF、EGFR、IL-6、CASP3、RELA、MAPK1、VEGFA、IL-1β等靶点可能是大黄-黄芪药对治疗DKD的关键靶点。TNF、IL-6、VEGFA、EGFR、RELA等涉及炎症反应[21],TP53、AKT1、MAPK1、CASP3等涉及细胞凋亡和细胞增殖[22-23]。IL-6被认为是慢性炎症产生的关键基因,DKD患者高糖和晚期糖基化产物诱导肾小管上皮细胞表达,并分泌IL-6,使其在机体内水平明显升高[24]。通过降低IL-1β、TNF、IL-6等炎性因子的表达,可抑制高糖介导的氧化应激反应,从而改善肾脏功能[25]。

大黄-黄芪药对是长期DKD防治临床实践中的精华,用药精少、疗效显著,前期已有大量的研究证实其可以有效延缓DKD患者肾功能恶化,本研究运用网络药理学探寻大黄-黄芪药对治疗DKD可能的作用机理发现,槲皮素、山柰酚、芦荟大黄素等多成分可作用于 IL-6、IL-1β、VEGFA等多靶点,参与糖尿病并发症的AGE-RAGE、PI3K-AKT、HIF-1等多信号通路,通过抗氧化应激、抗炎、改善足细胞损伤、抗纤维化等作用途径治疗DKD。本次网络药理学研究为大黄-黄芪药对防治DKD的机制提供了新的思路和方向,其具体有效成分、作用靶点与详细机制尚需进一步的实验验证。