微小RNA在病毒性心肌炎中的研究进展

张新悦 韩 波，2

1.山东大学齐鲁医学院，山东 济南 250012；2.山东第一医科大学附属省立医院小儿心脏科，山东 济南 250021

病毒性心肌炎（viral myocarditis， VMC）是一种心肌细胞的炎症性疾病，病理上表现为免疫活性细胞局灶性或弥漫性浸润心肌，多由柯萨奇病毒B3（Coxsackie virus B3， CVB3）感染引起［1］。目前对于VMC 的发病机制普遍认为包括病毒对心肌细胞的直接损伤与免疫机制2 个方面，但具体机制仍有待进一步研究。VMC的临床表现具有异质性，从轻微症状到急性心力衰竭、心源性休克等，严重者需进行机械循环支持。VMC患者的预后大多数良好，然而，有高达30%的心肌炎患者经活检证实最终发展为扩张型心肌病并出现相关并发症［2］。因此，进一步探索VMC 的发病机制以及寻找有效的早期生物标志物与治疗靶点十分重要。

近年来不断发展的分子技术推进了微小RNA（microRNA，miRNA）表达谱的研究。多项研究表明，心肌炎患者miRNAs 的表达与健康志愿者或非心肌炎患者的表达不同，提示miRNAs 有可能参与VMC 的发病机制，并有可能成为早期、敏感的诊断标志物。本文就miRNAs 在VMC 中的研究进展进行简要综述。

1 miRNAs概述

miRNAs 于20 世纪90 年代早期在秀丽隐杆线虫中发现［3］，是一类进化上保守、单链、小的（约19~ 23 个核苷酸）、内源性表达、非蛋白质编码的RNA，在广泛的动物、植物和病毒中作为基因表达的转录后调控因子。

在miRNAs的经典合成途径中，miRNAs最初通过RNA 聚合酶Ⅱ在细胞核中从基因内或基因间区域转录，形成含有茎环结构的初级miRNAs（primary miRNAs， pri-RNA）［4］。这些pri-miRNAs 在细胞核中由一种被称为微处理器的核蛋白复合物切割成大约70 ~ 100 个核苷酸长的茎环结构，称为前miRNAs（pre-miRNAs）［5］。该微处理器包括RNase-Ⅲ酶Drosha 以及双链RNA 结合蛋白Pasha（也被称为DiGeorge syndrome critical region 8 protein， DGCR8）［6-7］。随后pre-miRNAs通过Exportin 5从细胞核被输送到细胞质中［8］，被RNase-Ⅲ酶Dicer进一步切割成双链RNA［9］。双链解离后，一条链成为成熟的miRNA，另一条链（miRNA）被降解［10］。成熟miRNA 与AGO 组成RNA 诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex， RISC）发挥作用［11］。

miRNAs 的作用机制受与靶基因的互补程度影响。miRNA 通过位于5'端的种子区识别靶mRNA，当与靶mRNA 近乎完美互补时，靶基因被降解；与靶mRNA不完全匹配时，则抑制靶基因的翻译［12-13］，最终导致编码蛋白的表达下降。另有研究表明，部分miRNAs，如miR-92a，通过3'端与靶基因相互作用［14］。值得注意的是，有研究表明， miRNAs也可以作为增强子来调控基因表达而非仅有抑制基因表达的作用［15-16］。1个miRNA可以影响多个mRNAs，1个mRNA也可以受多个miRNAs调控［17］。

miRNAs 几乎在所有重要的生物过程中发挥作用，包括细胞增殖、分化与死亡，也参与了免疫机制、病毒复制、神经递质合成、胰岛素分泌等多种生理活动，并与多种疾病的发生发展相关，包括肿瘤、糖尿病、帕金森病等。在心血管系统中， miRNAs与心脏发育、心肌肥厚及心力衰竭等皆相关［18］。miR-1通过调节心脏转录因子Hand2来控制小鼠的心脏发育［19］。抑制miR-133的表达可导致伴随胎儿基因重新激活的心脏肥大反应［20］。Dicer 缺失导致心室重塑与显著的心房、心室扩大，同时miRNA 表达谱的分析显示了miRNA 耗竭与自发性心脏重塑之间存在因果关系［21］。miRNA 参与心血管疾病的病理过程已被广泛认可。

2 miRNAs在VMC调控机制中的作用

多种病毒均可引起VMC，包括肠道病毒、腺病毒、巨细胞病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒、细小病毒和其他病毒等，其中CVB3是最常见的病原体，也是建立VMC 动物与细胞模型最常用的病原体［22］。与其他许多病毒感染相同，CVB3 通过对宿主的直接损伤和宿主免疫系统中异常免疫反应引起的间接损伤引起VMC。在多项CVB3 诱导的VMC 模型研究中，miRNAs 被证实与CVB3 感染密切相关，对VMC的发生发展有重要的调控作用。

2.1 在CVB3复制中的作用

miRNAs 可以直接作用于病毒基因组，抑制其复制。Wang 等［23］通过生物信息学分析筛选出了在CVB3基因组中miR-342-5p的3个可能靶点，并通过实验进一步证实了miR-342-5p 可作用于CVB3 的2C 编码区的nt4989-nt5015，抑制病毒的生物合成。同时miRNA也可通过相关介质间接调控病毒复制。CVB3诱导的心肌炎小鼠中，miR-221/-222在心脏组织中高表达，而体外研究证实，miR-221/-222通过干扰素调节因子2（interferon regulatory factor 2，IRF2）、趋化因子（C‐X‐C 基元）配体12（基质细胞衍生因子1）［chemokine （C‐X‐C motif） ligand 12（stromal cell‐derived factor 1)， CXCL12］和胸腺细胞选择相关高迁移率族（thymocyte selection-associated high mobility group box， TOX）基因抑制CVB3复制，提示在CVB3感染过程中，机体试图通过增加miR-221/-222 的表达来消除病毒并保护心脏［24］。miR-21的过表达显著抑制了病毒子代释放，这一结果可能通过靶向MAP2K3/P38 MAPK 信号通路实现［25］。此外，circSIAE 可通过海绵吸附miR-331-3p靶向TAOK2，抑制CVB3病毒的复制和增殖［26］。

研究表明，miRNA 也可以促进CVB3 的复制。miR-10a 可通过靶向CVB3 的3D 编码区的nt6818-nt6941 直接促进病毒的生物合成［27］。而Hedima等［28］证实了蛋白激酶C/转录因子AP-1 通路的激活上调了CVB3 小鼠心脏中miR-203 的表达，miR-203靶向结合ZFP-148 并抑制其翻译，导致其下游靶基因细胞周期调节因子、肿瘤抑制因子和 Bcl-2 家族蛋白的差异表达，以促进细胞存活从而促进CVB3复制，加重对心肌的损伤。CVB3 感染也可以诱导miR-126 的表达上调，通过调节ERK1/2 和Wnt/β-catenin 信号通路来促进病毒复制与释放［29］。miR-30a可通过靶向TRIM25，抑制TRIM25和TRIM25介导的RIG-Ⅰ泛素化的表达，从而抑制IFN-β 的激活和产生，进而增强CVB3 的复制［30］。此外，circDDX17 可通过海绵吸附miR-1248 以调控NOTCH2，促进CVB3的复制［31］。

2.2 在免疫调节中的作用

先天性免疫相关细胞在CVB3感染早期即产生应答，向心脏趋化浸润并释放干扰素等炎症因子。巨噬细胞是先天性免疫的代表性细胞，包括发挥促炎作用的M1巨噬细胞与抗炎作用的M2巨噬细胞。CVB3 可诱导M2 巨噬细胞向M1 巨噬细胞极化，加重心肌炎症。据报道，miR-223 是参与巨噬细胞极化的炎症反应的有效调节因子［32］。Gou 等［33］发现，在CVB3感染小鼠的心脏组织和心脏浸润巨噬细胞中miR-223 的表达显著下调，上调miR-223 则显著抑制了M1 标志物诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和CD86 的表达，并促进了M2 标志物Arginase-1、Fizz-1 和CD206 的表达，抑制了γ 干扰素（interferon-γ， IFN-γ）、白介素-6（interleukin-6， IL-6）和白介素-10（interleukin-10，IL-10）的产生，改善了心功能；同时证明了miR-223直接靶向Pknox1抑制其表达，Pknox1过表达部分逆转了miR-223 过表达调控的极化表型。这提示，miR-223 可通过靶向Pknox1 调节巨噬细胞极化，减轻CVB3诱导的炎症和心肌损伤。

在心肌炎的后期阶段，获得性免疫相关细胞被激活，主要包括Th1、Th2、Th17、Treg细胞等。IFN-γ是Th1 细胞的标志性细胞因子，在心肌炎发病机制中促进炎症的发生。Th2 细胞主要释放IL-4，使用抗IL-4 单克隆抗体（monoclonal antibodies， mAb）可降低心肌炎的严重程度，这种改变与Th2 样表型转变为Th1样表型有关。IL-17是Th17细胞释放的典型细胞因子，在促进CVB3 感染中起关键作用［34］。在心肌炎中，Treg 细胞可减轻CVB3 诱导的心肌纤维化，防止心肌炎向扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy， DCM）的进展［35］。而miRNAs 在T细胞的分化与功能中发挥重要作用。miR-27 可通过下调宿主IFN-γ的表达来促进长期持续的病毒感染，是控制Th1 分化和IFN-γ 产生的负调控因子［36-37］；同时miR-27 在Treg 的发育与功能中也起着关键调节作用，可抑制IL-10 的产生并通过靶向c-Rel 负向调控Treg 细胞［38］。在Th2 细胞中，miR-24和miR-27 通过直接和间接方式靶向IL-4 和GATA3协同限制Th2 反应［37］。miR-221/miR-222 在控制Th17 免疫中起负向作用，miR-221/miR-222 的缺失可导致IL-17 的产生增加，并直接靶向IL-23R 和c-Maf 来调节Th17 分化［39］。而miR-183C 则通过靶向Foxo1来促进Th17功能［40］。

此外，miRNAs 也在VMC 中调节炎性细胞因子的产生与表达。在体外实验中，CVB3感染后细胞中miR-15 的表达显著上调，抑制miR-15 减少了IL-1β、IL-6和IL-18的生成，并且通过下调NLRP3和Caspase-1 p20的表达来抑制NLRP3炎性小体的激活，缓解炎症［41］。Liao 等［42］发现，pri-miR-10a 与VMC 的发生相关，并证实了miR-10a通过靶向E3 泛素蛋白连接酶（itchy E3 ubiquitin protein ligase， ITCH）促进IL-6的表达。而miR-133抑制TNF-α和IL-6的释放，并靶向RAS致癌基因家族成员Rab27B减轻CVB3感染诱导的心肌损伤［43］。以上结果说明，miRNAs通过免疫调节参与调控CVB3感染诱导的心肌炎症反应。

2.3 在心肌细胞凋亡中的作用

在CVB3 感染的早期阶段，病毒通过抑制细胞凋亡来促进细胞存活，以确保充分的扩增。在感染的后期，病毒会促进细胞凋亡，从而促进病毒的释放和传播。CVB3感染后，miR-34a、miR-217与miR-543 在心肌细胞中表达增加，通过靶向SIRT1，激活SIRT1-p53 信号通路，诱导心肌细胞凋亡［44-45］。此外，miR-34a 还可调控凋亡相关蛋白Bax 和Bcl-2 的表达［44］。而miR-222、miR-425-3p、miR-1和miR-133则作为抗凋亡分子在VMC 中发挥作用。Zhang等［46］发现，在VMC 小鼠心肌细胞中ADAR1p150 的表达升高，并与Dicer 形成复合物，促进miR-122 的表达，而miR-122 通过靶向PTEN 减少细胞凋亡。miR-423-3p 可下调Bax、Caspase-3，上调Bcl-2 的表达，减少心肌细胞凋亡，改善心肌功能。体外实验进一步证明， miR-423-3p 还可通过抑制TGF-β1 来减少细胞凋亡［47］。Li等［48］发现，miR-1/133模拟物可上调VMC 小鼠心肌中miR-1、miR-133、钾通道基因Kcnd2 和Kcnj2 以及Bcl-2 的表达，下调钾通道抑制基因Irx5、L型钙通道亚基基因a1c、Bax和Caspase-9的表达，降低心肌细胞的凋亡。这些研究证明了miRNAs参与调控CVB3感染后心肌细胞的凋亡，未来可以通过靶向这些miRNAs来干扰病毒诱导的细胞凋亡，阻止病程进展，促进心功能恢复。

2.4 心脏特异性miRNAs在VMC中的调控作用

miRNAs 的生物学特征之一是具有组织表达特异性，其在心脏中的特异性表达也得到了初步探索。Rao等［49］通过对健康成年小鼠心脏的深度测序发现，miR-1是在心脏中表达最丰富的miRNA，占所有已测序miRNAs 的近40%，let7/miR-98 和miR-30a-5p 则分别是心脏中第2 个和第3 个最丰富的miRNA 家族。而在VMC 中，Corsten 等［50］通过小鼠心脏的miRNAs 表达谱分析发现，心脏中miR-155、miR-146b 以及miR-21 在CVB3 诱导的心肌炎中特异性升高，并在人类心肌炎患者的心肌活检样本中得到证实。miR-1已被证明与心肌炎相关。在VMC小鼠模型中，miR-1 通过抑制连接蛋白43（connexin43， Cx43）促进心肌细胞的破坏并引发心律失常，Cx43 是心脏中表达的主要缝隙连接蛋白，调节心脏传导系统的正常功能。miR-98、miR-21则可作为抗凋亡分子，分别通过抑制FAS/FASL 基因和PDCD4 介导的细胞凋亡来有效缓解CVB3 诱导的心肌炎［51-52］。此外，多项研究证明，这些心脏特异性miRNAs 分子参与心肌炎的免疫调节。Zhang等［53］验证了抑制miR-30a-5p 可通过上调SOCS1 加速巨噬细胞向M2极化来改善VMC的心肌损伤。另有研究表明，沉默miR-155也会导致心脏中M2巨噬细胞水平升高［54］。miR-21 则被证明与miR-146b 一同参与对T 细胞分化的调节，抑制miR-21 和miR-146b的表达可降低Th17细胞的表达，改善炎症［55］。而miR-155 也可以通过驱动Th17/Treg 失衡，促进Th17 细胞的免疫反应，从而促进心肌炎的发展［56］。同时在一项纳入68 例VMC 患儿的随机对照试验中，黄芪可通过降低miR-155 和miR-146b 的水平，改善外周血Treg细胞免疫失衡，缓解炎症［57］。以上结果表明，心脏特异性miRNAs可能通过免疫机制，尤其是调控免疫细胞的分化来调控心肌炎的发生发展，并且miR-155 作为VMC 的免疫调控因子，可通过多种途径发挥作用，是心肌炎的加重因素。

3 miRNA在VMC诊断中的作用

心肌炎患者外周血中miRNAs的表达较健康对照者发生改变，这提示miRNAs 有希望成为诊断VMC的无创生物标志物。同时循环miRNAs可能有助于临床医生评估病情的严重程度并提示患者预后。Goldberg 等［58］发现，在儿童VMC 中，与亚急性期和缓解期/慢性期相比，血清中miR-21、miR-208a表达水平在急性期显著升高，同时miR-208b水平对左心室功能恢复具有预后意义。一项关于成人心肌炎的研究显示，血浆中miR-4763-3p 的水平显著升高，但在心肌梗死患者中的表达水平没有变化，对暴发性心肌炎（fulminant myocarditis， FM）的诊断表现出较高的敏感性和特异性［59］。另外一项纳入40 例VMC 患者的研究表明，外周血单个核细胞中miR-21-5p、miR-1-3p显著升高，miR-21-5p与左心室收缩功能障碍密切相关，而miR-1-3p随着心肌损伤程度的增加而增加［60］。而除循环miRNAs外，外泌体中miRNAs相对更为稳定。一项纳入99例成人心肌炎患者的研究显示，血清外泌体来源的miR-155 和hsa-miR-320a在诊断心肌炎方面显示出较高的准确性，并能够区分FM 与非暴发性心肌炎（nonfulminant myocarditis， NFM），并且miR-155 和hsa-miR-320a的联合诊断价值大于单独或联合使用C 反应蛋白（C-reaction protein， CRP）和肌钙蛋白［61］。Blanco-Domínguez 等［62］在小鼠和人类心肌炎患者中发现了一种新的miRNA，并发现人类同源物miR-Chr8：96 可用于区分心肌炎患者、心肌梗死患者和健康对照者。以上研究均证明了miRNAs有希望取代心内膜心肌活检，成为无创、敏感的特异性生物标志物。但miRNAs 作为疾病的诊断标志物，仍有几个问题需要面对。首先，miRNAs的提取与定量方法不同，可能会影响研究结果的准确性。其次，miRNAs的表达水平在心肌炎的不同时期有所改变，临床获取miRNAs用于诊断的时间点受患者就诊时间影响，miRNAs用于诊断的标准有待进一步确定；miRNAs是否能够在疾病早期即能识别心肌炎也有待进一步研究。最后，目前的大多数研究所纳入的人群缺乏心内膜心肌活检以证实心肌炎的诊断，并且多为单中心、小样本研究，仍需进行多中心、大样本的前瞻性研究来验证研究结果的可靠性。

4 miRNA在VMC治疗中的作用

miRNAs 在VMC 的发病机制中发挥重要作用，因此，可以设计药物抑制miRNAs 的表达以干扰病毒的复制与增殖，调节病毒诱导的免疫反应，或者促进保护性miRNAs 的表达，以减少心肌炎症与损伤。如CVB3感染通过提高小鼠VMC中的miR-1水平来降低Cx43 的表达，而黄芪提取物可通过降低miR-1 水平来对抗CVB3 诱导的心肌损害［63］。而miR-155 作为促进VMC 发展的调节因子，也可以成为潜在的治疗靶点。但值得注意的是，也有研究表明， miR-155 在CVB3 感染过程中降低心肌成肌细胞因子的表达，提高了CVB3感染后小鼠的存活率，作为VMC 的保护性因素发挥作用［64］。这些结论的不一致性提示，需要对miR-155 进行更加深入的机制研究，探索其是否具有反馈调节机制，以更好地为发展新的治疗策略服务。miRNAs在病毒疫苗研发方面也展示了较好的前景。He 等［65］发现，将miR-133 和miR-206 的目标序列插入到CVB3 基因组后，使用编辑后的CVB3 感染小鼠，miR-133 和miR-206 在心脏中特异性升高并减弱了CVB3 的复制。这提示了一种新的基于miRNAs的靶向策略来控制CVB3 的组织定向与发病机制，有利于病毒减毒与疫苗开发。

然而基于miRNAs的治疗方法在应用于临床前也仍面临一些问题。首先，需要寻找药物靶向运输的工具，若不能靶向调控心脏中miRNAs的表达，则可能造成对其他器官系统的功能损害。外泌体与纳米颗粒包裹给药是目前研究的新兴方向，需进一步研究靶向给药的可能性。其次，目前的研究大多是在小鼠中进行，而小鼠与人体有很大的差异，需要更多的动物模型以及在人群中的临床试验去证明治疗的有效性。

5 小结

综上所述，miRNAs 可通过促进或抑制病毒增殖、调节免疫反应以及影响细胞凋亡等方式参与VMC发病机制的调控，是探索心肌炎致病机制的重要研究靶点。同时miRNAs在循环中的表达同样发生改变，寻找VMC特异性的miRNAs，有希望使其取代有创的心内膜心肌活检，成为早期、无创、敏感的诊断标志物；并可以利用miRNAs评估病情预后，指导对于疾病的早期干预与治疗。根据miRNAs在发病机制中的作用，可以研发以miRNAs 为基础的治疗药物或病毒疫苗，对VMC进行更精准特异的治疗以及预防。对miRNAs的深入研究仍是今后研究者的努力方向，这将有利于更好地了解VMC，提供新的诊疗思路。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突。