类风湿关节炎患者血清lncRNA TUG1、miR-199a-3p表达水平及其与疾病严重程度的相关性▲

周文煜 陈文莉 甘文渊 申江曼

(1 华中科技大学同济医学院武汉中心医院肾病风湿科,湖北省武汉市 430014; 2 武汉市第四医院血液风湿科,湖北省武汉市 430030)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是临床上较为常见的一种自身免疫疾病,以进行性骨损伤、慢性炎症为主要临床特征,病变可累及四肢关节,引起关节畸形,造成关节功能障碍[1-2]。研究发现,RA的发病与机体内免疫失衡、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)表达失调、微生物感染、miRNA异常表达、炎症反应等有关[3-4]。有研究显示,lncRNA牛磺酸上调基因1(lncRNA taurine up-regulated gene 1,lncRNA TUG1)在RA的成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte,FLS)中表达上调,其可能通过影响FLS葡萄糖代谢及细胞凋亡进而影响RA的病理进程,lncRNA TUG1可能是诊治RA的潜在靶标[5]。此外,miR-199a-3p在RA的FLS中呈低表达,其可通过抑制FLS增殖、诱导FLS凋亡来参与RA的发生和发展,提示miR-199a-3p亦可能是RA的治疗靶点[6]。Li等[7]研究发现lncRNA TUG1可通过靶向结合miR-199a-3p促进尤文肉瘤细胞增殖、侵袭,但lncRNA TUG1、miR-199a-3p在RA中的相关性及二者与RA疾病严重程度的关系尚未明确。因此,本研究通过测定RA患者血清miR-199a-3p、lncRNA TUG1的表达水平,分析二者相关性及其与RA疾病严重程度的关系,为临床评估RA疾病严重程度提供新思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年1月至2021年11月华中科技大学同济医学院武汉中心医院收治的102例RA患者作为RA组,纳入标准:(1)符合《2018中国类风湿关节炎诊疗指南》中的RA诊断标准[8],且为首次确诊;(2)年龄30～70岁。排除标准:(1)合并高血压、强直性脊柱炎者;(2)合并糖尿病、系统性红斑狼疮者;(3)合并肿瘤、特发性血小板减少性紫癜者;(4)合并肾功能异常、严重感染者;(5)合并血液系统疾病或其他自身免疫系统病变者;(6)临床资料不全者。纳入同期在本院体检的健康者102例作为健康组,纳入标准:无RA或其他关节炎病史。排除标准:近期合并其他部位感染者。RA组中男性40例、女性62例,年龄30～70(53.28±13.12)岁;健康组中男性44例、女性58例,年龄30～70(54.73±13.60)岁。两组性别、年龄比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。研究对象或其家属对本研究知情同意,本研究经华中科技大学同济医学院武汉中心医院医学伦理委员会批准。

1.2 收集指标及其方法

1.2.1 血液样本收集:收集RA患者入院时及健康者体检当日清晨空腹外周静脉血5～6 mL,4 ℃下放置约30 min使其自然凝集,4 ℃、5 500 r/min离心5 min,取上层血清,分装,于-70 ℃冰箱冻存备用。

1.2.2 实时荧光定量PCR法检测血清lncRNA TUG1、miR-199a-3p表达水平:取适量血清解冻,使用TRIzol® LS Reagent(Ambion公司,型号:10296-010)提取总RNA,使用分光光度计(Thermo Fisher Scientific公司,型号:NanoDrop One)检测RNA浓度及纯度;使用HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(南京诺唯赞生物科技股份有限公司,型号:R111-02)制备cDNA;通过SYBR® Green Real-Time PCR Master Mix试剂盒[AMS Biotechnology (Europe) Limited,货号:AMS.AVP005-34]、实时荧光定量PCR仪(ABI公司,型号:StepOneTM)扩增cDNA,获取检测指标循环阈值(CT值)。反应体系包括cDNA 1 μL、2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、上游和下游引物各1 μL,加ddH2O 至总体积为20 μL。扩增反应为96 ℃预变性4 min,94 ℃ 变性30 s、58 ℃退火15 s、60 ℃延伸15 s(共40个循环)。lncRNA TUG1以GAPDH为内参,miR-199a-3p以U6为内参,各引物序列见表1,引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以2-ΔΔCt法计算lncRNA TUG1、miR-199a-3p相对表达水平。

表1 lncRNA TUG1、GAPDH、miR-199a-3p、U6引物序列

1.2.4 血清类风湿因子水平及血沉检测:取适量血清,以免疫比浊法检测血清类风湿因子水平,并利用血细胞分析仪(Beckman Coulter Life Science公司,UniCel® DxH800)依据魏氏法检测血沉。

1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计数资料以例数(百分比)表示,组间比较采用χ2检验;正态分布的计量资料以(x±s)表示,组间比较采用两独立样本t检验,多组间比较采用方差分析,两两比较采用SNK-q检验;采用Pearson检验进行变量的相关性分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 RA组和健康组血清lncRNA TUG1、miR-199a-3p表达水平的比较 与健康组相比,RA组患者血清lncRNA TUG1表达水平升高,血清miR-199a-3p表达水平降低(均P<0.05)。见表2。

表2 RA组和健康组血清lncRNA TUG1、miR-199a-3p相对表达水平的比较(x±s)

2.2 不同疾病活动度RA患者血清lncRNA TUG1、miR-199a-3p、类风湿因子水平及DAS28-CRP、血沉的比较 低活动组、中活动、高活动组RA患者的血清lncRNA TUG1表达水平、血清类风湿因子水平、DAS28-CRP及血沉均依次升高,而血清miR-199a-3p表达水平依次降低(均P<0.05)。见表3。

表3 不同疾病活动度RA患者DAS28-CRP及血清lncRNA TUG1、miR-199a-3p、类风湿因子水平,血沉的比较 (x±s)

2.3 RA患者血清lncRNA TUG1、miR-199a-3p表达水平与疾病严重程度评价指标的相关性 RA患者血清lncRNA TUG1表达水平与DAS28-CRP、血清类风湿因子水平及血沉均呈正相关,血清miR-199a-3p表达水平与DAS28-CRP、血清类风湿因子水平及血沉均呈负相关(均P<0.05)。见表4。

表4 RA患者血清lncRNA TUG1、miR-199a-3p表达水平与疾病严重程度评价指标的相关性

2.4 RA患者血清lncRNA TUG1表达水平与血清miR-199a-3p表达水平的相关性 RA患者血清lncRNA TUG1表达水平与血清miR-199a-3p表达水平呈负相关(r=-0.586,P<0.001)。

3 讨 论

RA是一种以滑膜炎为病理基础的免疫性疾病,其可伴有关节疼痛、肿胀、晨僵等症状,难以治愈,若不及时正确评估患者病情并给予正规治疗,可造成关节功能障碍,影响患者正常生活能力[10]。由于RA早期临床表现缺乏特异性,症状较为复杂多样,因此难以准确判断RA患者的病情严重程度。寻找可评估RA疾病严重程度的指标,及时制订对应干预措施,对于改善RA患者的生存质量具有积极意义。研究显示,DAS28-CRP可用于评估RA的疾病活动度[9]。类风湿因子是诊断和评估RA的敏感指标。另外,当机体存在炎症时,红细胞易聚集,血沉升高,所以血沉也是目前临床上用于评估RA疾病活动度的指标之一[11]。故本研究选用血清类风湿因子水平、血沉、DAS28-CRP作为评估RA疾病严重程度的指标。

lncRNA在炎症反应、免疫平衡、信号转导等过程中发挥重要调控作用[12-13]。研究发现,RA患者滑膜组织中lncRNA Gm15621表达水平降低,并通过调控相关信号轴抑制炎症反应来参与RA发生和发展[14]。另外,lncRNA转移相关肺腺癌转录本1在RA中呈低表达,通过影响NOTCH信号通路参与RA发病过程[15]。以上研究表明了RA发生和发展与lncRNA表达失调密切相关,探究RA相关lncRNA的表达及作用机制或许可以为RA的临床诊治提供新线索。lncRNA TUG1作为lncRNA的一员,在多发性骨髓瘤患者中呈高表达,且与患者预后相关,lncRNA TUG1可能可以作为诊断多发性骨髓瘤的辅助手段[16]。另外,研究发现lncRNA TUG1在骨关节炎的软骨样本中表达上调,通过调节软骨细胞外基质(extracellular matrix,ECM)降解来影响骨关节炎病理变化过程,lncRNA TUG1可能是治疗骨关节炎的靶标[17]。本研究中RA患者血清lncRNA TUG1表达水平较健康人群升高,这与Zhang等[5]的研究结果相似。此外,RA患者血清lncRNA TUG1表达水平随RA疾病活动度增加而升高,且与DAS28-CRP、血清类风湿因子水平、血沉均呈正相关,提示lncRNA TUG1可能参与了RA的病情发展过程,与RA疾病严重程度关系密切。lncRNA TUG1有望成为临床评估RA患者病情的潜在标志物,但目前相关作用机制尚不明确,推测上调的lncRNA TUG1可能通过调控有关信号通路,参与ECM降解[17],影响炎症反应,进而促进RA的病理进展。

miRNA可参与炎症反应、介导自噬,影响细胞凋亡过程,与系统性红斑狼疮、RA等密切相关[18-19]。miR-199a-3p作为miRNA的成员之一,在系统性红斑狼疮中表达下调,通过有关信号通路参与系统性红斑狼疮[20]。另外,Mishima等[21]研究发现,RA患者滑膜组织中miR-199a-3p表达水平降低,其可能通过影响前列腺素D2的产生来调节体内炎症反应,从而影响RA发展过程。本研究中RA患者血清miR-199a-3p表达水平降低,与Mishima等[21]的研究结果相似。此外,RA疾病活动度越高,RA患者血清miR-199a-3p表达水平越低,且miR-199a-3p表达水平与RA患者DAS28-CRP、血清类风湿因子水平、血沉均呈负相关,提示miR-199a-3p表达下调可能与RA疾病进程有关,测定血清miR-199a-3p水平有助于临床判定RA患者的病情。分析其原因可能是miR-199a-3p通过影响炎症因子产生,介导炎症反应,从而在RA病变过程中发挥调节作用。此外,本文分析了RA患者血清lncRNA TUG1表达水平与血清miR-199a-3p表达水平的相关性,结果显示,血清lncRNA TUG1表达水平与血清miR-199a-3p表达水平呈负相关,提示lncRNA TUG1可能与miR-199a-3p靶向结合进而共同影响RA病理过程。

综上所述,RA患者血清lncRNA TUG1表达水平上调,血清miR-199a-3p表达水平下调,二者均与RA疾病活动度显著相关。测定血清lncRNA TUG1、miR-199a-3p水平有助于评估RA疾病严重程度,可为临床评估RA患者病情提供新方向。但后期仍需扩大样本深入研究。