益脑心片的制备工艺和质量标准

薛彩红，滕明，周金艮

（南宁市中医医院药学部，南宁 530004）

随着中国经济发展和人民生活水平的提高，肥胖人群数量明显增加［1］，心脑血管病患病人数相应增加。《中国心血管病报告2018》报道中国心脑血管病患病人数已达2.9 亿人，心脑血管病死亡人数占居民疾病死亡人数的40%以上，高于肿瘤及其他疾病。心脑血管病的防治工作面临严峻挑战。中成药因安全性高、副作用较小，在治疗心脑血管疾病方面具有独特优势。益脑心颗粒是由川芎、制何首乌（Polygoni multiflori）、丹参、郁金、山楂、天麻（Gastrodiae rhizoma）组成的中成药，收载于《国家中成药标准汇编脑系经络肢体分册》，具有活血散瘀、平肝熄风的功能，用于血瘀肝旺所致眩晕头痛、心悸失眠、胸闷气短的治疗［2］，只有颗粒剂1 种剂型供临床使用。为解决因颗粒剂服用量大带来的不便，以及为临床患者提供更多剂型，本研究将益脑心颗粒剂型改良为片剂，对益脑心片的制备工艺及质量标准进行研究，为益脑心颗粒的二次开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器 单冲压片机（上海天凡药机制造厂）；BY-300 型糖衣机（中南制药机械厂）；ZF-20C 型暗箱紫外分析仪（上海宝山顾村电光仪器厂）；片剂四用测试仪（上海黄海药检仪器有限公司）；威玛龙LC-9000s 型色谱仪（含威玛龙工作站）；十万分之一电子天平（Mettler-Toledo）；万分之一电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）。

1.1.2 试剂 益脑心片（自制，批号20190601、20190602、20190603）；川芎、丹参、郁金、制何首乌、山楂、天麻均购自广西玉林药材市场；丹酚酸B 对照品（供含量测定用，批号111562-201917）、制何首乌对照药材（供鉴别用，批号121454-201806）、大黄素（供含量测定用，批号110756-201913）、天麻素（供含量测定用，批号110807-201809）均购自中国食品药品检定研究院；硬脂酸镁、滑石粉、淀粉均购自广西南宁医药有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；其他试剂均为分析纯。

1.2 制备工艺研究

1.2.1 丹酚酸B 的含量测定

1）色谱条件。以Agilent ZORBAX SB-C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）为填充剂，以乙腈-甲酸-去离子水（20∶1∶79）为流动相，检测波长为286 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为室温。

2）对照品溶液的制备。称取丹酚酸B 2.73 mg，加75%甲醇，制成每毫升甲醇含0.109 mg 丹酚酸B的溶液。

3）供试品溶液的制备。吸取益脑心片提取液1 mL，13 000 r/min 离心10 min，取上清液作为供试品溶液。

1.2.2 处方 川芎333.8 g、丹参208.8 g、郁金125.0 g、山楂250.0 g、制何首乌266.2 g、天麻66.2 g，制成益脑心片1 000 片。

1.2.3 提取工艺优化 原益脑心颗粒的提取条件为加去离子水煎煮3次，第1 次2.0 h，第2 次1.5 h，第3 次1.0 h。本研究通过正交试验（表1）对原剂型的提取条件进行优化，取1/4 倍量处方药材9份，按正交试验设计（表2）进行提取，药液过400 目滤布，合并滤液，静置4 h，取上清液，备用。吸取上清液20 mL，加去 离子水稀释1.5倍，12 000 r/min 离心15 min，取上清液，按“1.2.1”项下方法制备供试品溶液，注入色谱仪，测定丹酚酸B 的峰面积，计算提取液中丹酚酸B 提取量（Y）。

表1 益脑心片提取工艺正交试验因素与水平

1.2.4 提取工艺验证 取1/4 倍量处方药材3份，按照正交试验筛选的最佳组合进行提取，同法测定提取液中丹酚酸B 的提取量。

1.2.5 浓缩工艺 采用减压浓缩工艺，浓缩温度为65～85 ℃，相对密度为1.25～1.30（80 ℃）。

1.2.6 成型工艺研究 取稠膏，加入天麻细粉，混匀，70 ℃干燥成干膏，粉碎，加适量辅料混匀，用70%乙醇制软材，挤压制粒，70 ℃干燥，整粒，加入0.5%的硬脂酸镁，混匀、压片（硬度5～6 kg/cm2，平均质量0.27 g）、包糖衣、川蜡打光，即得。

1.3 质量标准研究

1.3.1 性状 肉眼观察益脑心片的外观、性状，鼻子闻气味。

1.3.2 鉴别

1）制何首乌。取益脑心片40片，去除糖衣，研细，加50 mL 甲醇，超声波 处理（250 W，50 kHz）30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加入10 mL 去离子水使其溶解，加1 mL 盐酸，水浴加热30 min，加1%氢氧化钠溶液调节pH 至10，加乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯层，蒸干，残渣加2 mL 乙酸乙酯使其溶解，作为供试品溶液。取缺制何首乌的阴性样品10 g，同法制成阴性样品溶液。取制何首乌对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。取大黄素对照品适量，加三氯甲烷制成每毫升含0.5 mg 大黄素的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法，吸取上述4 种溶液各5～10 μL，分别点于同一硅胶H 薄层板上，以石油醚-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）为展开剂，展开、取出、晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。

2）天麻。取益脑心片40片，去除糖衣，研细，加水饱和的正丁醇50 mL，超声波处理（250 W，50 kHz）30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加2 mL 去离子水使溶解，通过D101 型大孔吸附树脂柱（内径为1 cm，柱高为12 cm），依次用去离子水15、20 mL 洗脱（流速为1 mL/min），收集20 mL 去离子水洗脱液，蒸干，残渣用2 mL 甲醇溶解，作为供试品溶液。取缺天麻的阴性样品6 g，同法制成阴性样品溶液。取天麻素对照品，加甲醇制成每毫升含1 mg 天麻素的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法，吸取上述3 种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-去离子水（9∶2∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%磷钼酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。

1.3.3 检查 按照《中华人民共和国药典》［3］（简称《中国药典》）片剂项下有关规定（通则0101），对益脑心片外观、崩解时限、微生物限度进行检查。

1.3.4 含量测定 按照《中国药典》［3］高效液相色谱法（通则0512）测定。

1）色谱条件。色谱柱为Agilent ZORBAX SBC18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-甲醇-1%甲酸溶液（10∶20∶70），检测波长为286 nm，流速为1.0 mL/min。

2）对照品溶液的制备。称取丹酚酸B 对照品适量，加75%甲醇，制成每毫升甲醇含0.205 mg 丹酚酸B 的溶液。

3）供试品溶液的制备。取益脑心片20片，去除糖衣，研细成细粉（过三号筛），取0.5 g，加入75%甲醇50 mL，称定重量，超声处理（250 W，50 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4）线性与范围。分别吸取2.0、2.5、5.0、7.5、10.0、20.0 μL 丹酚酸B 对照品溶液，注入液相色谱仪。以丹酚酸B 进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。

5）仪器精密度。取丹酚酸B 对照品溶液，连续6次注入液相色谱仪，测定峰面积，并进行评价。

6）重复性。取益脑心片（批号20190601），按“1.3.4”项下方法制备6 份供试品溶液，注入液相色谱仪，测定峰面积，并进行评价。

7）回收率。取益脑心片适量（批号20190601），研细，取粉末0.500 0 g，精密称定，共6份，分别加入1.0 mL 丹酚酸B 对照品溶液，加入75%甲醇100 mL，称定重量，超声波处理（250 W，50 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，过滤，取续滤液，测定丹酚酸B 峰面积，外标法测定丹酚酸B 的含量并计算回收率。

8）益脑心片中丹酚酸B 的含量测定。取益脑心片（批号20190601、20190602、20190603），按“1.2.1”项下的色谱条件测定，计算益脑心片中丹酚酸B 的含量。

2 结果与分析

2.1 提取工艺的正交试验

2.1.1 正交试验 益脑心片提取工艺正交试验结果见表2。由方差分析结果（表3）可知，提取时间、溶剂用量对丹酚酸B 提取量无显著影响（P＞0.05），提取次数有显著影响（P＜0.05）。影响因素由大到小依次为次数、时间、溶剂用量。综合方差和极差分析，确定益脑心片的最佳提取工艺条件为A1B1C1，即加8倍去离子水煎煮1 h。

表2 益脑心片提取工艺正交试验结果

表3 益脑心片提取工艺正交试验结果的方差分析

2.1.2 正交试验结果验证 取1/4 倍量处方药材3份，按照A1B1C1工艺条件提取，同法测定提取液中丹酚酸B 的提取量。丹酚酸B 平均提取量为1 160.83 mg，相对标准偏差（RSD）为3.61%（n=3），表明该提取工艺稳定、可行、重复性好。

2.1.3 优化后的益脑心片提取工艺 天麻粉碎成细粉，备用；川芎、制何首乌、山楂、丹参、郁金加8 倍去离子水煎煮1 h，煎液滤过，静置4 h，取上清液，滤过，减压浓缩至相对密度为1.25～1.30（80 ℃）的稠膏，即得。

2.2 成型工艺

2.2.1 辅料筛选 以颗粒成型性为评价指标，取适量辅料（种类及用量见表4）与干膏粉混合均匀，加70%乙醇制软材，制粒。选用硫酸钙-磷酸氢钙混合物（质量比为1∶1）（试验号2）、滑石粉（试验号5）作为填充剂得到的颗粒成型性、可压性好。益脑心片细粉黏性强、较易吸湿，需加入具有抗吸潮能力的辅料，而滑石粉是常用的防潮辅料。本研究选用滑石粉（含量为5%）作为辅料，不但颗粒成型性好、可压性好，其防吸潮能力也得到很大改善，满足制备工艺需要。

表4 益脑心片处方中填充剂的选择

2.2.2 筛选后的益脑心片制剂成型工艺 取稠膏，加入天麻细粉，混匀，干燥（70 ℃）至干膏，粉碎成细粉，加入5%的滑石粉，混匀，以70%乙醇溶液制粒，干燥（70 ℃），整粒，加入硬脂酸镁，混匀、压成1 000片、包糖衣，即得。

2.3 性状

益脑心片为糖衣片，去除糖衣后显棕褐色；味苦。

2.4 鉴别

由图1 可知，益脑心片供试品在与制何首乌对照药材、大黄素对照品色谱的相同位置处，有相同颜色的斑点，斑点显色清晰，阴性对照不干扰主斑点。由图2 可知，益脑心片供试品在与天麻素对照品色谱的相同位置处，有相同颜色斑点，斑点显色清晰，阴性对照不干扰主斑点。

图1 益脑心片中制何首乌鉴别的TLC

图2 益脑心片中天麻鉴别的TLC

2.5 检查

益脑心片外观完整光洁，包衣色泽均匀，无色斑；在崩解时限检查中，各片均在1 h 内全部崩解；在微生物限度检查中，细菌数、霉菌及酵母菌数符合《中国药典》［3］的规定，未检出控制菌。

2.6 含量测定

2.6.1 专属性 取除丹参外的其余药材及辅料，制备缺丹参的阴性样品，再按“1.2.1”项下供试品溶液制备方法制成缺丹参的阴性溶液，注入色谱仪，测定。由图3 可知，供试品溶液中丹酚酸B 峰分离度大于1.5，阴性对照对丹酚酸B峰无干扰。

2.6.2 线性与范围 线性回归方程为Y=991 619X+101 641（r=0.999 4），表明当丹酚酸B 进样量为0.41～4.10 μg，进样量与峰面积的线性关系良好。

2.6.3 仪器精密度 丹酚酸B对照品溶液中丹酚酸B峰面积的RSD为0.9%（n=6），表明该仪器精密度良好。

2.6.4 重复性 益脑心片供试品溶液中丹酚酸B 峰面积RSD为1.3%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.6.5 回收率 由表5 可知，该方法测定丹酚酸B的平均回收率为99.7%，RSD为1.4%（n=6），表明该方法可以准确测定供试品溶液中丹酚酸B 的含量。

表5 回收率测定结果

2.6.6 含量测定结果 3 批益脑心片中丹酚酸B 的含量分别为2.35、2.42 和2.32 mg/片，平均含量为2.36 mg/片。

3 小结与讨论

益脑心片处方中的川芎具有活血化瘀的功效，有效成分为水溶性成分（阿魏酸等）［4］；丹参具有祛瘀止痛、活血通经的作用，活血化瘀有效成分为水溶性成分（丹参素、丹酚酸B 等）；山楂具有行气散瘀的功效，有效成分为水溶性成分（黄酮类）；制何首乌可用于高血脂的治疗，有效成分为水溶性成分（2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷等）［5，6］。可见处方中各饮片有效成分以水溶性成分为主，因此益脑心片采取水提工艺是合理的。

在原剂型（益脑心颗粒）制剂制备工艺中天麻为打粉入药，但质量标准中却未对天麻进行鉴别，为提高益脑心片的质量标准，本研究采用TLC 法对益脑心片中天麻进行定性鉴别。参考《中国药典》［3］天麻鉴别方法进行益脑心片薄层鉴别，但是供试品与对照品色谱相应位置有褐色斑点，且背景较深，影响了主斑点颜色判断。本研究对该方法进行了改良，在新条件下，供试品与对照品相同位置显相同褐色斑点，斑点清晰，Rf为0.5，阴性样品无干扰，可收入益脑心片的质量标准草案。

在制剂含量测定研究中，丹参水溶性成分与丹参药效作用密切相关，具有很强的清除自由基和抗氧化作用。自由基参与机体多种疾病包括衰老的发生和发展过程，清除自由基、提高机体抗氧化能力，是防治多种疾病的重要途径之一。丹酚酸是丹参水溶性成分之一，可以清除自由基，减少自由基对机体的损伤，从而产生保护作用，同时通过广泛的药理作用，调节和改善机体的机能状态，促进受损机体组织的修复和复原，达到预防和治疗疾病的目的［7-10］。原剂型质量标准中，已建立丹参中水溶性成分原儿茶醛的含量测定项，但是含量限度（无蔗糖型）仅为万分之0.6，不符合中药新药质量标准制定的要求。本研究选择丹参中水溶性成分丹酚酸B 作为制剂含量测定指标，所建立的丹酚酸B 含量测定法更合理，适用于益脑心片的质量控制。

综上，本研究的益脑心片制备工艺稳定，质量控制方法准确、可靠，为益脑心颗粒的二次开发提供依据。