山东省禽源性大肠杆菌耐药性研究*

姜晓彤，王义敏，何元龙，秦永彪，朱传才,潘维善

（山东华农生物制药有限公司，山东 临朐 262600）

禽大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的禽类下痢、呼吸道感染和败血症等多种临床表现的疾病。较常见的症状有心包炎、肝周炎、腹膜炎、输卵管炎、气囊炎等[1]。随着禽规模化养殖的迅速发展，致病性大肠杆菌对养禽业造成的损失日趋增加[2]。长期以来大肠杆菌病主要依赖抗生素进行防控，但抗生素的长期滥用导致禽大肠杆菌的耐药菌株不断出现，耐药性不断增强，耐药谱不断扩大，增加了临床防控难度[3]。本研究对山东地区疑似患大肠杆菌病的家禽进行大肠杆菌分离鉴定，并对其进行药物敏感性试验，从而了解大肠杆菌对常用抗菌药物的耐药情况，以期为禽大肠杆菌病的临床用药提供指导及理论依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源

从山东省各地区收集疑似患有大肠杆菌病的鸡，经剖检观察初步诊断是否患有大肠杆菌病，在无菌环境下取其病变的器官(如肝脏或卵黄)，做好标记及时放于冰箱4 ℃冷藏备用。

1.2 主要试剂

营养肉汤（北京陆桥）、 伊红美蓝琼脂培养基（北京陆桥）、 乙腈（天津富宇）、甲酸（天津大茂）、无水乙醇（烟台远东）、α-氰基-4-羟基肉桂酸（北京毅新博创）、药敏试验纸片：阿莫西林钠（40 μg/片）、庆大霉素（20 μg / 片）、单硫酸卡那霉素（20 μg/片）、安普霉素（20 μg/片）、氟苯尼考（20 μg/片）、盐酸土霉素（30 μg/片）、泰乐菌素（30 μg/片）、多西环素（20 μg/片）、磷霉素钠（20 μg/片）、粘杆菌素（15 μg/片）、利福平（20 μg/片）、克林霉素（20 μg/片）、痢菌净（20 μg/片）、环丙沙星（15 μg/片）

1.3 主要仪器与耗材

高压蒸汽灭菌锅（上海申安）、电热恒温培养箱（常州国宇）、恒温摇床（常州国宇）、飞行时间质谱系统Clin-ToF-Ⅱ型仪器（北京毅新博创）、超净台（上海树立）、耗材有解剖剪、接种环、消毒镊子、酒精灯、灭菌试管、培养皿、移液枪及枪头等。

1.4 大肠杆菌的分离鉴定

将冷藏备用的病变器官表面灼烧灭菌，在无菌条件下用灭菌接种环钩取内部病料，接种到伊红美蓝培养基上，37 ℃培养18 h，观察菌落生长状态，对疑似大肠杆菌菌落进行编号E-1、E-2……E-59，通过质谱系统进行鉴定。具体步骤：用接种环取单菌落于300 μL纯水中，加入900 μL无水乙醇，震荡，12 000 r/min离心2 min，弃去乙醇，继续12 000 r/min离心2 min，自然干燥；加50 μL 70%甲酸，充分震荡，再加50 μL 乙腈，充分震荡，12 000 r/min离心2 min，取1 μL上清点到靶板上，室温干燥，加1 μLα-氰基-4-羟基肉桂酸覆盖在样品上，自然干燥，然后上机检测；置信度≥25分，表示结果可信，大肠埃希氏杆菌ATCC8739为仪器校正菌种，即标准株。

1.5 大肠杆菌抗生素药物敏感试验

采用K-B纸片法，将分离鉴定的大肠杆菌进行药物敏感试验。挑取鉴定后的单个菌落接种于营养肉汤中，37 ℃培养18 h，然后用平板表面散布法进行活菌计数，统一调整细菌浓度为5×108CFU/mL。取100 μL均匀涂布于培养基上，室温干燥3~5 min，用无菌镊子夹取不同抗生素药敏纸片，按一定间隔贴在平板的不同区域，两纸片间距不小于24 mm，纸片距离平板边缘不小于15 mm，并做好标记。药物敏感试验判定标准即抑菌圈直径标准判定：若抑菌圈直径大于20 mm，判为高敏；若抑菌圈直径为10~20 mm，判为中敏；若抑菌圈直径为小于10 mm，判为低敏；若抑菌圈直径为0，判为抗药。

2 结果分析

2.1 大肠杆菌的分离鉴定结果

从59份样品中分离得到45株疑似大肠杆菌菌株，分离的菌株在伊红美蓝培养基上长出黑色、稍凸的圆形菌落，直径大小约2~5 mm，菌落边缘整齐且表面光滑湿润，并带有金属光泽（图1）；表1为飞行时间质谱系统鉴定结果。经质谱系统鉴定后，45株菌的鉴定结果显示置信度均≥25。

表1 飞行时间质谱系统鉴定结果

图1 大肠杆菌在伊红美蓝培养基上的菌落形态（详见附录彩图）

2.2 大肠杆菌的抗生素药敏结果

见表2。45株大肠杆菌的耐药试验显示，对泰乐菌素的耐药率达100%，对克林霉素的耐药率高达95.6%，对阿莫西林钠、盐酸土霉素、磷霉素钠的耐药率超过80%；对环丙沙星敏感度相对较高，高敏菌株比例占20%，对庆大霉素、安普霉素、粘杆菌素、利福平、痢菌净、环丙沙星有一定的敏感度，中高敏菌株的比例超过60%。

表2 大肠杆菌药敏结果

3 讨论

长期以来禽大肠杆菌病主要依靠抗菌药物进行防控，导致大肠杆菌的耐药菌株不断出现，耐药性增强，耐药谱扩大。本试验分离的45株禽大肠杆菌对14种药物存在不同程度的耐药性，环丙沙星的敏感度相对较高，高敏株比例占20%；对庆大霉素、安普霉素、多西环素、粘杆菌素、利福平、痢菌净敏感性变化比较大；对泰乐菌素、克林霉素、阿莫西林钠、盐酸土霉素、磷霉素钠的耐药性较高。本试验结果与牛玉娟[4]、柳志余[5]等人的结果部分相近，分离培养的禽大肠杆菌对环丙沙星、庆大霉素、安普霉素、粘杆菌素、痢菌净等有一定的敏感性，这说明了目前我国禽源性大肠杆菌的耐药情况基本类似，同时对部分药物如磷霉素钠、氟苯尼考的敏感性也存在着一定的差异，这可能与养殖场的用药情况有一定的关系，由于不同养殖取样用药习惯差异，导致不同区域耐药性差异较大。细菌的耐药性除了与养殖场的投药有直接关系外，还与当地的气候变化也有密不可分的联系，因此要实时动态监测大肠杆菌对药物的敏感性，选择合适的药物进行预防和治疗，针对不同地区的耐药程度，选择敏感的药物进行防治。

4 小结

大肠杆菌是一种条件性致病菌，本身存在于动物体内。防治大肠杆菌病的发生，首先要改善饲养环境，加强饲养管理，落实好卫生防疫措施，以减少各种诱发的因素；另外，在临床上不要盲目地长期、大剂量使用同一种药物，以避免造成耐药性菌株出现，使用抗生素时注意联合用药及交替用药，以减少人力、物力的浪费。同时要根据机体的临床症状，采取综合措施，及时调整治疗方案，防止病情的复杂化。