砧木及抗性马尾松松脂组分对松材线虫的响应

李文华　刘青华　周志春等

关键词：马尾松；松材线虫；砧木；抗性；松脂组分

中图分类号：S763.1 文献标识码：A 文章编号：1001-1498（2023）04-0001-11

马尾松（Pinus massoniana Lamb.）广泛分布于我国亚热带地区，适应性强，在土层深厚的土壤中生长较快，是我国主要的产脂、用材和荒山造林先锋树种。其松脂是由分泌细胞分泌的无色透明次生代谢产物，可以分离成松节油和松香，主要由萜类物质组成，贮藏于松树的针叶、枝和茎的木质部和韧皮部的树脂道系统中，在针叶树种的防御体系中有着重要的作用。此外，松脂广泛应用于香料、医药、机械、造纸、油墨等行业，也是我国重要的工业原料及可再生环保资源。

松材线虫病被称为松树的“癌症”，最快两个月内可导致感染植株死亡。马尾松常易感染松材线虫病，但有些松树（如湿地松、火炬松）却明显具有抗病性。据国家林业和草原局统计，近30年来，全国因松材线虫病损失的松树累计可达数十亿株，造成直接经济损失和生态服务价值损失高达上千亿元，松材线虫病已成为全球森林生态系统中最具危险性、毁灭性的病害之一。

松属植物在遭受生物或非生物刺激时，能够经树脂道分泌化学防御物质松脂进行自我保护；受到创伤时，其分泌的松脂将伤口封闭，并为入侵生物制造有毒的环境。已有相关研究表明，松脂的各类组分功能不同，萜类化合物可以抑制细菌、真菌和病毒感染，蒎烯类是松树防御反应的重要化合物，单萜类化合物具有良好的杀虫效果；倍半萜类与松材线虫病抗性也有紧密联系。

嫁接技术可能对提高植物抗逆境能力和对病虫害抵抗能力有一定程度改善。不同苹果砧木影响植物在胁迫环境下生长受抑制情况，耐性强的砧木可通过调节自身生理特征以适应胁迫环境；新疆葡萄不同砧木间也存在抗旱能力差异。本文通过分析不同砧木及不同抗性马尾松接种松材线虫后各松脂组分动态变化，揭示砧木对马尾松抗松材线虫病影响及马尾松对松材线虫病害的响应机制，进一步为防治马尾松松材线虫病提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验材料

马尾松试验林设在浙江省临海市林业技术推广和场圃旅游服务总站（28°88′N，121°01′E），属亚热带季风气候，四季分明，雨量充沛，温暖湿润，年平均气温17.30℃，全年无霜期242 d，年平均降水量1638.10 mm，年平均日照时数1936.40h，土壤类型为红壤。试验材料取自5年生马尾松嫁接苗测定林，包括共有16个无性系，马尾松砧木为浙江马尾松一代良种‘5410种子园混合种子，依据前期对砧木接种松材线虫，砧木全部死亡；湿地松砧木为G-222优良种子，对砧木接种松材线虫，致死率为30%。两种砧木所用马尾松穗条均为休宁5（4级）。根据前期安徽省林业科学研究院对马尾松无性系对松材线虫病的抗性指数测定，划分为1～4级，其中1级为易感，4级为高抗。于2018年选择高抗无性系休宁5（4级）和易感无性系黄山1（1级）各10株，在试验前未采过松脂；供试松材线虫材料为高致病性、高繁殖性线虫株系‘广株3B，此种松材线虫分离种群多次继代培养的松材线虫繁殖速度比初代培养的要慢5～6代，繁殖能力下降。试验所用线虫为从当年新枝中分离出来，并经鉴定为‘广德38，于灰葡萄孢菌落上纯培养，保存于4℃冰箱中备用。

1.2试验方法

1.2.1松材线虫培养及接种 将灰葡萄孢接种在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，于28℃霉菌培养箱恒温培养5d。待着色菌落生长到培养皿上盖后，将所选高致病性松材线虫材料接种到灰葡萄孢菌落中，在28℃恒温培养约10 d，使菌落完全被松材线虫取食。采用贝尔曼漏斗法将松材线虫分离，12 h后，将其收集在10 mL离心管中，无菌水冲洗3次，并以300 r.min^-1离心5 min，以去除上清液。将所得各离心管中的松材线虫汇聚混匀，最后制备成每1μL含有50条松材线虫的悬浮液。

于2018年7月对马尾松接种松材线虫（图1）。分别选取10株马尾松砧木马尾松和10株湿地松砧木马尾松、10株高抗马尾松和10株易感马尾松接种松材线虫悬浊液。参考Liu等处理方法进行接种与样品采集。所取样品包括上述40株马尾松，包括接种前、接种后1、7、15和30 d4个取样时间点，每株马尾松取3个重复。

1.2.2松脂收集及化学组分分析每个无性系采用3个重复，从每个试验区系统选择了1～2株生长最佳的健康马尾松植株进行松脂收集测定，在植株胸径处划出一条长约20 cm、宽1～2 mm、深3～4 mm的斜口，采用下降式单刀采脂法收集松脂。将新鲜松脂收集于5 mL聚乙烯管中，在松脂达到管体积的2/3时，立即封闭管口并放人冰盒中，置于-20℃冰箱中保存待测。

利用气相色谱·质谱联用技术（GC/MS）分析和测定松脂各组分含量。样品制备参考Karanikas的方法，使用Agilent 6890N气相色谱和Agilent59758质谱联用，检测马尾松的松脂组分含量。获得的片段通过与NTST08谱库（National Institute of Standards and Technology，USA）匹配来进行松脂化学组分的识别，根据各组分与内标的面积确定各组分在松脂中的含量。

1.2.3萜类化合物对松材线虫的影响 以前期所用灰葡萄孢菌落培养的松材线虫，接种于PDA培养基中培养，用贝尔曼漏斗法将分离出的松材线虫装在2 mL离心管中，制成含有500条松材线虫的1 mL悬浊液。将纯度为97%的α-蒎烯标准品、纯度为98%的β-蒎烯标准品、纯度为98%的长叶烯标准品、纯度为97%的柠檬烯标准品、纯度为97%的β-月桂烯标准品及98%的龙脑标准品以一定浓度梯度作用于松材线虫，在25℃条件下培养24 h；以Triton X-100为对照，技术重复3次；选取处理后0.5、6、24 h为时间节点观察线虫致死率。

2结果与分析

2.1砧木对马尾松抗性的影响

2.1.1不同砧木马尾松主要松脂组分及含量 接种松材线虫后，马尾松砧木和湿地松砧木马尾松均无发病症状（图2d，2e）。对以马尾松和湿地松为砧木的马尾松松脂进行GC-MS检测，选择与NTST08匹配度高于90%、含量超过0.01%的萜类松脂化学组分（图3），结果表明：两种砧木马尾松均检测出19种松脂组分，其中单萜类6种，倍半萜类7种，二萜类6种（表1）。通过对各松脂组分含量方差分析表明：倍半萜含量在两种砧木马尾松间无显著差异，平均含量约为90.00～130.00 mg·g^-1；单萜含量与二萜含量在两种砧木马尾松间存在显著差异，其中湿地松砧木单萜含量较马尾松砧木高9.64%，马尾松砧木二萜含量较湿地松砧木高2.85%。

a.蒎烯含量在单萜中最高，在不同砧木马尾松间存在显著差异（p<0.05），且湿地松砧木含量较马尾松砧木高8.02%。长叶烯、石竹烯和枞酸在不同砧木马尾松间具有显著差异（p<0.05），且湿地松砧木石竹烯含量高于马尾松砧木85.24%、马尾松砧木长叶烯含量与枞酸含量分别高于湿地松砧木25.22%与39.76%。α-石竹烯、反式-β-金合欢烯和去氢枞酸含量在不同砧木马尾松间也存在显著差异（p<0.05）。

β-蒎烯平均含量约为17.10～19.30 mg·g^-1、β-月桂烯平均含量约为0.50～1.70 mg·g^-1、柠檬烯平均含量约为1.50～4.30 mg·g^-1、水芹烯平均含量约为59.00～69.00 mg·g^-1、龙脑平均含量约为10.80～19.00 mg·g^-1，在两种砧木马尾松间均无显著差异。长叶蒎烯、环长叶烯、洒剔烯、海松酸、山达海松酸、左旋海松酸／长叶松酸和新枞酸含量在两种砧木马尾松间也无显著差异。

2.1.2不同砧木接种松材线虫后松脂化学组分动态变化两种砧木马尾松接种松材线虫1d后松脂组分中萜类含量略有增加，但均无显著差异。α-蒎烯、β-蒎烯和龙脑在两种砧木马尾松中含量变化规律相似。对马尾松砧木马尾松接种松材线虫后不同时间松脂化学组分均值分析（图4a），结果表明：β-月桂烯、柠檬烯和新枞酸含量变化规律为先上升后下降，且在7d最大值15 d最小值；海松酸含量变化规律为上升趋势，且在15 d达最大值；洒剔烯等含量变化无显著差异。对湿地松砧木马尾松接种松材线虫后不同时间松脂化学组分均值分析（图4b），结果显示：海松酸含量变化规律为先上升后下降，且7d最大值15 d最小值；洒剔烯含量变化规律为逐渐上升，且在15 d最大值。β-蒎烯、柠檬烯和新枞酸等含量变化无显著差异。在两种砧木马尾松接种松材线虫7d时，新枞酸仅在马尾松砧木中达最大值，而海松酸仅在湿地松砧木中达最大值，且萜类组分含量在两种砧木马尾松间均无显著差异。

接种松材线虫后α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、龙脑、海松酸和新枞酸含量在两种砧木马尾松间无显著差异。β-月桂烯含量在接种松材线虫1d后马尾松砧木显著高于湿地松砧木（p<0.05）（图5a）；β-月桂烯含量在接种松材线虫7d后马尾松砧木显著高于湿地松砧木（p<0.05）（图5b）；在接种松材线虫15 d后各组分含量在马尾松砧木与湿地松砧木间无显著差异（图5c）。

2.2不同抗性马尾松接种松材线虫后松脂化学组分分析

2.2.1不同抗性马尾松主要松脂组分及含量 接种松材线虫后，高抗马尾松无症状出现，易感马尾松在接种后7d即出现针叶枯黄现象，并在接种后30 d时全部枯死（图2c，2f）。在组织结构上，易感马尾松组织结构接种松材线虫1d时有轻微损伤（图2a，2b）。高抗马尾松和易感马尾松松脂共检测出19种松脂组分，对高抗与易感马尾松松脂进行GC-MS检测，选择与NTST08匹配度高于90%、含量超过0.01%的萜类松脂化学组分，结果表明：高抗与易感马尾松均检测出19种松脂组分，其中单萜类6种，倍半萜类7种，二萜类6种（表2）。其中，高抗与易感马尾松松脂组分仅在含量上有差异，方差分析表明：高抗与易感马尾松倍半萜和二萜含量之间无显著差异，在松脂中平均含量分别约为80.00～100.00 mg·g^-1和680.00～710.00 mg·g^-1。而在单萜含量中存在显著差异，其中高抗马尾松单萜含量比易感马尾松单萜含量高7.34%。

α-蒎烯含量在单萜中含量最高，在不同抗性马尾松间存在显著差异（p<0.05），高抗马尾松含量较易感马尾松含量高9.28%。β-蒎烯、β-月桂烯、柠檬烯、长叶烯在不同抗性马尾松间有显著差异（p<0.05），且除β-月桂烯外高抗马尾松含量分别高于易感马尾松43.70%、39.37%、4.59%。水芹烯平均含量约为56.00～64.00 mg·g^-1、石竹烯平均含量约为4.00～5.50 mg·g^-1。长叶蒎烯、环长叶烯、洒剔烯、α-石竹烯、反式-β-金合欢烯、海松酸、山达海松酸、左旋海松酸／长叶松酸、去氢枞酸、枞酸和新枞酸含量在不同抗性马尾松间也无显著差异。

2.2.2不同抗性马尾松接种松材线虫后松脂化学组分动态变化

高抗与易感马尾松接种松材线虫1 d后松脂组分中萜类含量略有增加，但无显著差异。对高抗马尾松接种松材线虫后不同时间松脂化学组分均值分析（图6a），结果显示：α-蒎烯、β-月桂烯、柠檬烯、长叶烯和α-石竹烯含量变化规律为先上升后下降，且7d达最大值15 d达最小值；β-蒎烯和龙脑含量变化规律先上升后下降，且7d达最大值0d达最小值；海松酸和去氢枞酸含量变化规律为逐渐上升，且15 d达最大值。对易感马尾松接种松材线虫后不同时间松脂化学组分均值分析（图6b），结果显示：含量先上升后下降且7d达最大值15 d达最小值的为新枞酸；含量为7d达最大值Od达最小值的为反式-β-金合欢烯；含量呈上升趋势15 d达最大值的为海松酸和去氢枞酸；含量7d达最小值15 d达最大值的为水芹烯和环长叶烯；含量呈下降趋势15 d达最小值的为α-石竹烯和枞酸。

α-蒎烯和β-蒎烯含量在接种松材线虫1d后高抗马尾松显著高于易感马尾松（p<0.05）（图7a）；α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯与长叶烯含量在接种松材线虫7d后高抗马尾松显著高于易感马尾松（p<0.05）（图7b）；在接种松材线虫15 d后各组分在高抗与易感马尾松间无显著差异（图7c）。

2.3萜类对松材线虫的影响

参考马尾松松脂化学组分的主要萜类化合物含量，检测松脂中主要萜类化学物对松材线虫的抑制作用。根据所测松脂组分含量及刘青华等研究中马尾松松脂萜类的平均含量，设置不同浓度梯度的α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯和长叶烯溶液，研究相应萜类对松材线虫的影响。结果表明，与对照组相比，α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、长叶烯、β-月桂烯和龙脑溶液的松材线虫平均存活率随着化合物浓度和处理时间的增加而逐渐下降（图8）。在α-蒎烯梯度浓度溶液中，150 mg·g^-1浓度下处理24 h松材线虫全部死亡，而在500 mg·g^-1浓度下处理0.5 h即造成松材线虫全部死亡（图8A）。在β-蒎烯梯度浓度溶液中，不同浓度溶液处理0.5 h后松材线虫致死率达约50%，处理24 h后松材线虫致死率趋于100%（图8B）。在长叶烯梯度浓度溶液中，10 mg·g^-1浓度下处理0.5 h松材线虫达80%致死率（图8C）。在柠檬烯梯度浓度溶液中，3.60mg·g^-1浓度下处理0.5 h后松材线虫致死率趋于100%（图8D）。在β-月桂烯梯度浓度溶液中，1.20 mg·g^-1浓度下处理24 h松材线虫致死率达约50%，2.40 mg·g^-1浓度下处理24 h松材线虫致死率达约85%（图8E）。在龙脑梯度浓度溶液中，13.00 mg·g^-1浓度下处理24 h松材线虫致死率达约50%.50.00 mg·g^-1浓度下处理24 h松材线虫致死率达约80%（图8F）。

3讨论

不同砧木马尾松和不同抗性马尾松树干木质部松脂中共检出19种组分，与古研等和张振洪等检出的组分基本一致。α-蒎烯、β-蒎烯、长叶烯、水芹烯、洒剔烯、海松酸、左旋海松酸／长叶松酸、脱氢枞酸、枞酸和新枞酸为松脂中含量较高的组分。

不同砧木马尾松松脂组分含量响应松材线虫变化差异较小。松材线虫入侵松属植物后，刺激分泌纤维素酶等细胞壁相关蛋白，类毒液过敏原蛋白等激发寄主产生防御反应，进而在接种后的7 d左右引起萜烯类次级代谢产物的大量积累。本研究中，在两种砧木马尾松接种松材线虫7d时，新枞酸仅在马尾松砧木中达最大值，而海松酸仅在湿地松砧木中达最大值，且萜类组分含量在两种砧木马尾松间均无显著差异。马尾松对松材线虫抗性可能与砧木无关，马尾松更易感染松材线虫病可能由于自身不断进化，形成更适宜松材线虫寄生的群体组成结构。

马尾松响应松材线虫入侵进行的主动防御造成萜烯类物质大量增加，而不同抗性马尾松接种松材线虫后松脂组分变化情况有所不同。抗性指数越高，产脂量越高，其单萜含量越高。高抗马尾松中α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、柠檬烯、龙脑、长叶烯与α-石竹烯含量在接种7 d时达最大值，含量动态变化呈先上升后下降趋势。易感马尾松中反式-β-金合欢烯、去氢枞酸与新枞酸含量在接种7d时达最大值。接种松材线虫7d时，α-蒎烯、β-蒎烯、长叶烯与柠檬烯含量在高抗马尾松与易感马尾松之间存在显著差异（p<0.05），且均为高抗马尾松显著高于易感马尾松。Zhao等研究发现，松材线虫入侵后，马尾松释放的挥发性物质主要为α-蒎烯、β-蒎烯和长叶烯三种蒎烯类物质；Kuroda等研究发现，松材线虫入侵黑松后，单萜的含量明显增加，其中α-蒎烯含量增加到健康松树的2～4倍，β-蒎烯和几种其他的单萜含量是健康松树的2～3倍；本研究结果与上述研究结果基本一致。

通过将α-蒎烯、β-蒎烯、长叶烯、柠檬烯、β-月桂烯与龙脑萜类组分对松材线虫进一步梯度浓度试验表明：α-蒎烯溶液随浓度升高对松材线虫毒害作用越大，而150 mg·g^-1浓度下处理24 h松材线虫全部死亡。β-蒎烯溶液不同浓度溶液处理0.5 h后松材线虫即达到约50%致死率，对松材线虫抑制作用与溶液浓度无关。长叶烯溶液随浓度升高对松材线虫抑制作用越大，10 mg·g^-1浓度下处理0.5 h松材线虫达到80%致死率。柠檬烯溶液在3.60 mg·g^-1浓度下处理0.5 h后松材线虫存活率趋于100%。β-月桂烯1.20 mg·g^-1浓度下处理24 h松材线虫致死率约50%。龙脑13.00 mg·g^-1浓度下处理24 h松材线虫致死率达约50%，且致死率升高较慢。上述结果与Liu等对马尾松研究结果相同，α-蒎烯、β-蒎烯、长叶烯和柠檬烯在低浓度下即可抑制松材线虫的存活，是马尾松萜烯类主要防御成分；Niu等对马尾松研究发现也得出相似结论，α-蒎烯、β-蒎烯等单萜类化合物在低浓度下具有抑制松材线虫繁殖的作用。

4结论

马尾松和湿地松树干木质部松脂中共检测出19种松脂组分，α-蒎烯、β-蒎烯、水芹烯、反式-β-金合欢烯、海松酸、山达海松酸、左旋海松酸／长叶松酸、去氢枞酸、枞酸和新枞酸在松脂中含量占比较高。松材线虫入侵树体后，萜烯类次生代谢产物在7d后大量积累并发生显著变化。α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、柠檬烯、龙脑、海松酸和新枞酸含量在不同砧木马尾松接种松材线虫7 d时达最大值，其组分含量在两种砧木间无显著差异性，由此可得，砧木对马尾松松材线虫抗性并无影响。接种松材线虫7d时α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、柠檬烯、龙脑、长叶烯、α-石竹烯、反式-β-金合欢烯和新枞酸含量在不同抗性马尾松间动态变化有所不同，α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、长叶烯为抗性马尾松显著高于易感马尾松（p<0.05）；α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯与长叶烯低浓度下抑制松材线虫活性，与马尾松抗性有关，是马尾松萜烯类主要防御成分。