茯茶山楂降脂含片的制备工艺及其降脂作用研究

孙颖　王慧　杨文娟　李楠　郝雨　周成东　杨盼

摘要：以茯茶多糖和山楂提取物为主要原料，采用压片法制备茯茶山楂降脂含片.通过预实验、体外降脂实验和正交试验筛选主辅料配比；以片剂外观、口感、硬度和崩解时限作为综合评分指标对配方进行综合评价，筛选出茯茶山楂降脂含片的最佳配方为：主药用量为15%（山楂∶茯茶=4∶1），填充剂用量为70%（可溶性淀粉∶甘露醇=1∶3），粘合剂为5%PEG6000 和50%乙醇溶液，PVPP用量为10%，硬脂酸镁用量为0.8%，矫味剂用量为3%（山梨糖醇∶柠檬酸=2∶1）.结果表明，产品的崩解时限均大于10 min，感官评价良好，茯茶山楂降脂含片对HepG2细胞的降脂和抗氧化作用良好，为降脂产品的开发与工业化生产提供一定的理论依据和数据支持.

关键词：茯茶多糖； 山楂提取物； 含片配方； 降脂作用

中图分类号：TS272文献标志码： A

Study on the technology of making fuzhuan tea fructus crataegi

tablet and its effects on lowering lipids

SUN Ying， WANG Hui*， YANG Wen-juan， LI Nan，

HAO Yu， ZHOU Cheng-dong， YANG Pan（School of Food Science and Engineering， Shaanxi University of Science & Technology， Xi′an 710021， China）

Abstract：With Fuzhuan Tea polysaccharide and Fructus Crataegi extract as the primary raw ingredients，tablet pressing was used to create a lipid-lowering buccal tablet of Fuzhuan Tea and Fructus Crataegi.Using a preliminary experiment，an in vitro lipid-lowering experiment，a single factor test，and an orthogonal test，the quantities of active and auxiliary substances were evaluated.The formulation was evaluated using the appearance，taste，hardness，and dissolution time of the tablets as comprehensive scoring indexes，and the optimal formulation was identified as follows：15% of the active ingredient （Fructus Crataegi∶Poria tea=4∶1），70% of the filler （soluble starch∶mannitol=1∶3），5% PEG6000 50% ethanol solution as the binder，10% PVPP，and 0.8% magnesium stearate.The concentration of flavoring ingredient was 3% （sorbitol∶citric acid=2∶1）.The results showed that the disintegration duration of the goods exceeded 10 minutes，and the sensory rating was favorable.Fuzhuan Tea Fructus Crataegi Lipid-lowering buccal tablets showed that they lowered lipids and acted as antioxidants in a good way on HepG2 cells.This gives a theoretical basis and real-world evidence for the development and mass production of lipid-lowering products.

Key words：fuzhuan tea polysaccharide; fructus crataegi extract; buccal tablet formulation; lipid-lowering effect

0引言

茯磚茶起源于明朝，在我国主要产自陕西和湖南［1，2］.研究表明，茯茶中富含茶多酚、茶氨酸和茶多糖等活性物质，具有抗氧化、保肝护肝、抗炎、抗肥胖、降血脂、免疫刺激和抗肿瘤活性等功效.因此，其具有较高的医药开发和保健价值［3-7］.

山楂又名红果，为药食两用蔷薇科植物，是我国传统中药之一，味酸甜，性微温，入脾胃肝经［8-10］.研究表明，山楂中富含黄酮类、有机酸类、三萜类和糖类物质，具有消食开胃、保护胃黏膜、降压、降血脂、抗动脉粥硬化、抗氧化、免疫调节、抗心肌缺血、抗癌和保护视网膜等作用［11-14］.

目前，关于天然产物与胆酸盐结合能力的研究主要集中于壳聚糖和膳食纤维，而对多糖及黄酮与胆酸盐的体外结合能力研究较少，且市面上关于茯茶与山楂复合制备的口含片较少［15］.因此，本试验以复配后的茯茶和山楂为材料，通过模拟体外胃肠道环境中其对胆酸盐的吸附能力，筛选体外降血脂活性最优的原料配比，制成茯茶山楂降脂口服含片，以期填补茯茶山楂降脂口服含片的研究空白，并促进山楂和茯茶在医药药学领域的应用.

1材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1主要材料

茯茶：咸阳泾渭有限公司；山楂：通化市三宝参茸商贸有限公司；柠檬酸、甘露醇、PEG 6000、山梨糖醇、硬脂酸镁、芦丁、可溶性淀粉、低取代羟甲基纤维素、甘胺胆酸钠、牛黄胆酸钠：上海源叶生物科技有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、正丁醇、无水乙醇、氯仿：天津市天力化学试剂有限公司；DMEM高糖培养基：生工生物工程（上海）有限公司；油酸：美国Sigma公司；胎牛血清、胰酶-EDTA：美国 Gibco 公司；磷酸二氢钠、硫酸、胆酸钠：上海麦克林生化科技有限公司；甘油三酯（TG）检测试剂盒、丙二醛（MDA）检测试剂盒、谷胱甘肽（GSH-Px）检测试剂盒、总胆固醇（TC）检测试剂盒、总SOD活性检测试剂盒：南京建成生物工程研究所.

1.1.2主要仪器

THDP-6压片机：上海天阖机械设备有限公司；LB-2D型崩解时限测定仪：上海南海药检仪器厂；HC-150T2型高速多功能粉碎机：永康市绿可食品机械有限公司；HR150A 洛氏硬度计：北京吉泰科仪设备检测有限公司；ZRS-8G智能溶出试验仪：安徽鸿重医疗器械有限公司.

1.2试验方法

1.2.1工艺流程图

原料粉碎提取→加填充剂→加矫味剂→加崩解剂→均匀混合→加粘合剂→制软材→14目筛网制粒→干燥→16目筛网整粒→加润滑剂→压片

1.2.2茯茶多糖的提取和测定

（1）茯茶多糖的提取［16］

茶叶经预处理后得到茯茶粗粉，水浴提取，Sevage法去除茯茶中的蛋白，醇沉浓缩，冷冻干燥，沉淀称重、备用.

（2）茯茶多糖含量的测定

茯茶多糖的测定方法：将茯茶多糖配制成0.1 mg/mL溶液，分别取3份0.5 mL 0.1 mg/mL茶多糖溶液，各加水至1 mL，按戚向阳等［17］的多糖含量测定方法进行操作，根据回归方程计算茯茶多糖中葡萄糖的含量.

1.2.3山楂总黄酮的提取和测定

（1）山楂总黄酮的提取［18］

将山楂洗净、晾干，粉碎得到山楂粉末.水浴条件下进行乙醇回流提取，过滤提取液，浓缩、冻干、定容、备用.

（2）山楂提取物中总黄酮的含量测定

山楂提取物总黄酮的测定方法：称取山楂提取物1 g，蒸馏水溶解，过滤，用2.5 mL的甲醇溶解在25 mL的标准容量瓶中，加水定容至刻度，振荡摇匀后吸取2 mL转移至25 mL的标准容量瓶中，按刘贤贤等［19］的总黄酮含量测定方法进行操作，根据回归方程计算山楂提取物中总黄酮的含量.

1.2.4体外结合胆酸盐能力

人体胃肠道pH环境模拟及胆酸盐结合：称取适量样品于具塞试管中，分别加入1 mL 0.01mol/L的盐酸溶液，37 ℃恒温震荡消化2 h，调pH至7.6，加入4 mL胆酸盐溶液，37 ℃恒温震荡2 h，4 000 r/min，离心20 min，取上清液.

样品测定：分别取样液2.5 mL，按胡凯等［20］的体外结合胆酸盐能力测定方法进行操作，根据回归方程计算样液中胆酸盐的浓度，重复3次.计算公式如下：

胆酸盐结合率=（1-C₁/C₀）×100% （1）

式（1）中：C₁——样品溶液的胆酸盐浓度（mmol/L）；C₀——空白溶液的胆酸盐浓度（mmol/L）.

1.2.5含片的综合评价

对含片的外观、口感、硬度和溶化性进行综合评分.综合评分＝外观评分×2+口感评分×3+溶化性评分×2+硬度评分×3，评分标准如表1所示.

1.2.6含片制备单因素实验

基础单因素条件为：PVPP 10%，山楂12%，茯茶3%，5% PEG6000 50%乙醇溶液，硬脂酸镁0.8%，矫味剂3%（山梨糖醇∶柠檬酸为2∶1），填充剂70%（可溶性淀粉∶甘露醇为1∶3）.分别在可溶性淀粉∶甘露醇为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3；PVPP为7%、8%、9%、10%、11%；粘合剂乙醇浓度为30%、40%、50%、60%、70%；硬脂酸镁为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%；山梨糖醇∶柠檬酸为1∶1、1.5∶1、2∶1、1∶1.5、1∶2条件下，考察填充剂的质量比、崩解剂用量、粘合剂乙醇浓度、润滑剂用量及矫味剂质量比对茯茶山楂降脂含片综合评价的影响.

1.2.7正交试验分析优化茯茶山楂降脂含片的制备工艺

在单因素实验的基础上，选取可溶性淀粉与甘露醇比例、乙醇浓度、硬脂酸镁用量、山梨糖醇与柠檬酸比例四个因素，设置四因素三水平正交试验，如表2所示.

1.2.8验证性试验

结合正交试验结果，制备3组茯茶山楂含片，对其进行综合指标评分，验证最优制备工艺的重现性.

1.2.9茯茶山楂降脂含片的质量评价

按《中国药典》2020版第四部附录的检查方法对含片的外观、片重差异、硬度、崩解时限、溶出度进行了检查［21，22］.取茯茶山楂降脂含片2片，约1 g，用蒸馏水溶解，按照芦丁和葡萄糖标准曲线的方法测定吸光度，分别代入芦丁和葡萄糖的标准曲线回归方程计算含片中总黄酮和多糖的含量.取含片5片，分别于1 min、3 min、5 min、10 min、20 min、30 min时，取溶液5 mL（并及时补液5 mL），过滤，精密量取续滤液1 mL，加溶出介质稀释至100 mL，摇匀，测定吸光度，计算溶出度.

1.2.10体外降脂活性评价方法

（1）HepG2細胞培养

用含10%胎牛血清和1%青链双抗的DMEM高糖培养基于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，细胞密度达到80%时进行传代，取对数生长期细胞用于后续实验.

（2）口含片溶液的配置

取口含片研磨粉碎，用双蒸水充分溶解，1 500 rpm离心5 min，取上清，0.22 μM无菌过滤器过滤，冻干备用，使用前用无血清培养基配制为所需浓度.

（3）细胞分组

取传代次数较少且生长状态良好的HepG2细胞，将其接种于6孔板（1×105/孔）中，孵育过夜.当细胞密度达到80%～90%时，将其分为六组，分别为：对照组（NC）；400 μM油酸组（MC）；50 μg/mL口含片溶液组（LD）；100 μg/mL口含片溶液组（MD）；200 μg/mL口含片溶液组（HD）.对照组加入含2%血清的培养基培养24 h，而其他组加入含400 μM油酸和2%血清的培养基培养24 h.

（4）细胞内总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）测定［23］

按照（3）的方法完成细胞培养后胰酶消化，将细胞悬液离心（1 000 r/min ）10 min，向细胞沉淀中加入1 mL PBS混匀，冰水浴条件下超声破碎细胞，当细胞破碎完全后，不进行离心，参照总胆固醇及甘油三酯说明书测定其含量.

（5）氧化应激指标测定［24］

按照（4）的方法破碎细胞后，取上清按照试剂盒明书操作检测SOD、GSH-Px、MDA.

2结果与讨论

2.1茯茶提取物多糖和山楂提取物黄酮的含量测定2.1.1茯茶提取物多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，如图1所示.得到的线性回归方程为：y=30.39x + 0.007 6，R²=0.998 6.据此计算得出茯茶提取物多糖含量为8.80%.

2.1.2山楂提取物总黄酮含量测定

以芦丁为标准溶液绘制标准曲线检测山楂提取物总黄酮含量，如图2所示.得到的线性回归方程为：y=14.188x-0.014 7，R²=0.998 7.据此计算得出山楂提取物总黄酮含量为6.73%.

2.2体外结合胆酸盐能力测定来确定主药山楂和茯茶的比例2.2.1胆酸盐标准曲线的建立

以胆酸盐浓度为横坐标，387 nm处所得吸光度值为纵坐标绘制胆酸盐标准曲线，如图3所示.其线性回归方程为：y=17.311x+0.169 1，R²=0.995 1.

2.2.2山楂茯茶比例筛选结果

图4（a）显示了不同山楂、茯茶比例的胆汁酸结合能力.当山楂∶茯茶为4∶1时，胆汁酸结合能力达到最大值54.03%，说明该比例有很好的体外降脂活性，故处方中山楂∶茯茶为4∶1.

图4（b）显示了山楂、茯茶和山楂∶茯茶为4∶1时口含片的胆汁酸结合能力.山楂、茯茶和口含片与胆汁酸的结合能力分别为28.37%、43.12%和54.03%，说明山楂∶茯茶为4∶1时具有协同降脂作用.

2.3单因素实验的结果

2.3.1填充剂质量比的筛选结果

按照1.2.6节所述的方法制备茯茶山楂降脂含片，以综合指标评分为考察指标进行筛选.

不同质量比的填充剂制备的茯茶山楂降脂含片的综合指标评分如图5所示.由图5可知，随着甘露醇用量的增加，综合指标评分增加.当可溶性淀粉∶甘露醇的质量比为1∶3时达到最大值96.52.因此，可溶性淀粉与甘露醇最佳质量比为1∶3.

2.3.2崩解剂用量的筛选结果

按照1.2.6节所述的方法制备茯茶山楂降脂含片，以综合指标评分为考察指标进行筛选.

不同用量的崩解剂制备的茯茶山楂降脂含片的综合指标评分如图6所示.由图6可知，随着崩解剂用量的增加，综合指标评分先上升后下降，当崩解剂用量为10%时达到最大值97.57.因此，崩解剂最佳用量为10%.

2.3.3粘合剂乙醇浓度的筛选结果

按照1.2.6节所述的方法制备茯茶山楂降脂含片，以综合指标评分为考察指标进行筛选.

粘合剂不同浓度乙醇制备的茯茶山楂降脂含片的综合指标评分如图7所示.由图7可知，随着乙醇浓度的增加，综合指标评分先上升后下降，当乙醇为50%时达到最大值93.51.因此，粘合剂乙醇最适浓度为50%.

2.3.4润滑剂用量的筛选结果

按照1.2.6节所述的方法制备茯茶山楂降脂含片，以综合指标评分为考察指标进行筛选.

不同用量的润滑剂制备的茯茶山楂降脂含片的综合指标评分如图8所示.由图8可知，随着润滑剂用量的增加，综合指标评分先上升后下降，当润滑剂用量0.8%时达到最大值73.因此，润滑剂最佳用量为0.8%.

2.3.5矫味剂质量比的筛选结果

按照1.2.6节所述的方法制备茯茶山楂降脂含片，以综合指标评分为考察指标进行筛选.

不同质量比的矫味剂制备的茯茶山楂降脂含片的综合指标评分如图9所示.由图9可知，当山梨糖醇∶柠檬酸为2∶1时达到最大值96.53.因此，山梨糖醇与柠檬酸最佳质量比为2∶1.

2.4正交试验优化实验结果

由表3可知，4个因素对结果影响的大小为可溶性淀粉与甘露醇的比值（A）>粘合剂乙醇浓度（B）>硬脂酸镁的添加量（C）>山梨糖醇与柠檬酸的比值（D），可溶性淀粉与甘露醇的比值对含片影响最大，山梨糖醇与柠檬酸的比值对含片影响最小.最优组合为A₂B₂C₂D₂，最佳配方为：填充劑为可溶性淀粉∶甘露醇=1∶3，粘合剂为5%PEG6000 50%乙醇溶液，PVPP用量为10%，脂酸镁的用量为0.8%，矫味剂为山梨糖醇∶柠檬酸=2∶1.

2.5验证性试验结果

由表4可知，三次重复实验，综合评分与正交试验所得结果相近，即A₂B₂C₂D₂为最佳处方.

2.6茯茶山楂降脂含片的质量评价结果

茯茶山楂降脂含片如图10所示，产品为浅黄棕色，表面有光泽；酸甜适中，无异味；净含量允差在（500.0±50） mg，符合2020年版《中国药典》的标准［21］；崩解时限均大于10 min.含片中多糖含量和黄酮含量如表5所示，测得含片中多糖平均含量为3.17 mg，百分含量为0.32%，黄酮平均含量为14.23 mg，百分含量为1.42%.除此之外，含片中多糖及黄酮在30 min平均溶出度达到68.62%和76.12%，溶出速率和程度都符合藥典要求，表明含片中主要活性物质能够在规定时间内溶出释放出来，进而发挥药理作用（如表6和表7所示）.

2.7茯茶山楂降脂含片对细胞中总胆固醇和甘油三酯含量的影响

肝脏脂质积累是NAFLD（非酒精性脂肪性肝病）的关键组成部分，因此检测了HepG2细胞中总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）的水平，确定茯茶山楂降脂含片对细胞中脂质的影响.

由图11（a）可知，MC组中TC含量是NC组的1.67倍，但经过口含片处理后，细胞内脂质累积呈剂量依赖性地减少.与MC组比，MD组可使TC降低24.55%，HD组降低26.94%.测量细胞内TG含量（如图11（b）所示）.与NC组相比，MC组TG含量升高1.98倍，但经过口含片处理后，LD组使TC降低6.98%，MD组降低20.96%，HD组降低29.03%.结果表明，茯茶山楂降脂含片对HepG2细胞的NAFLD具有明显的降脂作用.

2.8茯茶山楂降脂含片对细胞中氧化应激指标的影响超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是氧化应激的重要生物标志物，SOD和GSH-Px可保护细胞免受氧化损伤.从图12（a）、（b）可以看到，MC组SOD、GSH-Px水平比NC组显著降低，分别降低41.66%和57.96% （***P<0.001）.与MC组比，经过口含片处理后，细胞内SOD与GPX活力呈剂量依赖性增加.MD、HD组与MC组间有明显差异（***P<0.001）.

油酸导致MC组中MDA浓度显著增加，是NC组的2.09 倍 （***P<0.001，如图12（c）所示）.HD组使细胞中的MDA浓度显著降低 （***P<0.001）.因此，口含片可以降低MDA水平，改善脂代谢异常，减轻肝脏脂肪变性.因此，茯茶山楂降脂含片具有良好的抗氧化能力，有效地改善抗氧化状态.

3结论

本研究通过单因素实验和三水平四因素正交试验，得到最佳配方：主药用量为15%（山楂∶茯茶=4∶1），填充剂用量为70%（可溶性淀粉∶甘露醇=1∶3），粘合剂为5%PEG6000 50%乙醇溶液，PVPP用量为10%，硬脂酸镁的用量为0.8%，矫味剂用量为3%（山梨糖醇∶柠檬酸=2∶1）为降脂产品的研究提供一种有效的配方.此外，对茯茶山楂降脂含片的降脂作用进行研究，发现HepG2细胞TC、TG、MDA含量降低，SOD、GSH-Px水平增强，口含片为200 μg/mL时降脂和抗氧化效果明显（***P<0.001）.本试验采用科学有效的方法为进一步探究其有效成分和作用机制提供理论依据，为今后降脂产品的研发方向提供参考.

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