DNA甲基化在钚辐射损伤机制中的研究进展

刘晓明　古晓娜　苏丽霞等

关键词：DNA 甲基化;辐射致癌;钚接触人群

中图分类号：Q691;Q7 文献标识码：A

钚是核工业中的主要放射性核素。Pu-239物理半衰期为2. 41×10⁴a，人体内半减期为178a，其对人体的健康危害主要来源于衰变过程中释放的高传能线密度（LET）α 粒子，通过吸入、皮肤伤口进入人体，造成人员的内照射损伤。钚为亲骨性和亲网状内皮细胞系统的极毒放射性核素，进入人体后有约90%的钚在人体内环境中迁移，主要分布在肺、肝脏、骨骼等器官组织中，可以导致肺癌、肝癌和骨肉瘤。国际癌症研究机构（IARC）于2012 年将钚列为Ⅰ类致癌物。钚的辐射致癌效应是辐射防护与辐射生物效应研究领域的关注重点。

钚辐射致癌损伤的分子机制主要是由于α 粒子导致复杂的DNA 双链断裂集簇性损伤，加上自由基或二级电子的作用，产生继发性DNA 损伤，其修复难度大、错误修复率高，最终导致染色体畸变、基因突变等生物效应[1] 。

事实上，电离辐射作为基因毒剂，损伤DNA分子就已启动了细胞恶性转化的程序，其关键点在于是否改变了某些关键基因（如癌基因、抑癌基因）的结构和功能，导致细胞增殖失调和向恶性转化。但直到目前，还没有发现辐射诱发的基因突变具有明显的位点特异性，突变热点也少有报道。

因此，目前研究认为电离辐射除导致基因结构的改变外，通过产生表观遗传改变，可导致某些关键基因的表达变化，影响生物学功能，如促使癌基因激活、抑癌基因失活、干扰细胞周期调控等。国际放射防护委员会（ICRP）103 号报告指出，电离辐射存在基于表观遗传的远后效应，尤其是DNA 甲基化的改变[2] 。

1 DNA 甲基化与疾病关系

1. 1 DNA 甲基化及其生物学意义

DNA甲基化是表观遗传修饰的主要形式，作为表观遗传学的一项重要内容，日益受到人们的重视。表观遗传是指不改变基因原有序列而改变基因表型，通过转录调节等最终导致基因表达量改变的一种生物学机制[3] 。

DNA 甲基化是指在甲基转移酶（ DNA methyltansferase，DNMT）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，在基因组CpG 二核苷酸的胞嘧啶5碳位共价键结合一个甲基基团，形成5-甲基胞嘧啶的DNA 修饰序列[4] 。

DNA 甲基化具有多种生物学意义，生物体正常的DNA 甲基化维持，对于维护基因组稳定性及基因正确的时空表达具有重要意义。如基因组结构的稳定、基因印迹、细胞分化、雌性个体X 染色体的失活和胚胎的正常发育等[5-6] 。

在基因组中，CpG 岛是基因启动子区的一段长约0. 5～2 kb 的CpG 富集区。人类基因组中约有29 000 个CpG 岛，其中约一半分布于基因的启动子区。不同基因启动子区CpG 岛的甲基化状态是不同的，90% 以上的管家基因（ house-keepinggenes）启动子区CpG 岛是非甲基化的，而某些原癌基因及微卫星序列区域的CpG 岛则是高甲基化[7] 。甲基化模式的异常改变将直接导致人类疾病甚至癌症的发生[8] 。

越来越多研究表明，异常甲基化及甲基化模式的改变与癌症的发生发展有着密切的关系[9] 。癌细胞具有甲基化异常的特征，即全基因组DNA低甲基化和启动子区DNA 高甲基化[10] 。关于DNA 甲基化在肿瘤发生过程中作用机制，目前形成了以下结论：

①癌变细胞中出现基因突变的概率要远远低于预期。而在转录水平，发现高达5%的已知基因在肿瘤细胞中发生了异常的启动子DNA 高甲基化[11-12] 。因此可以推测，与基因突变相比，DNA甲基化改变在细胞恶变过程中可能发挥了更大的作用。

②在哺乳动物细胞中，全基因组DNA 低甲基化是肿瘤形成的原因之一。全基因组DNA 低甲基化可通过增加染色体不稳定性，引起转座子异常表达及导致基因组印记丢失等机制促进肿瘤的发生及演进[13] 。

③几乎所有的人类肿瘤中都存在肿瘤相关基因的异常甲基化。这些异常改变是肿瘤抑制基因失活的机制之一[14] 。

这些基因涉及细胞周期调控、细胞凋亡、细胞间信号传导、DNA 损伤修复及肿瘤的侵袭转移等过程。根据文献调研，目前的研究多集中在以下几类基因的研究，主要包括：细胞周期调控基因：p16、p15[15] 、APC[16] 、p14、p53、p73、RASSF1A[17-18] 、CDKN[19-20] 等; DNA 损伤修复基因： MGMT[11] 、hMLH1[12] 、BRCA1[21] ;肿瘤细胞侵袭转移相关基因：DAPK、TIMP、E-cadherin[22] 。

1. 2 DNA 甲基化应用

DNA 甲基化作为肿瘤发生的早期分子事件，可能为肿瘤的临床筛查、早期诊断、预后判断提供一种新的生物标志物。而且已有研究表明，DNA甲基化谱具有明显的肿瘤类型特异性。针对一种肿瘤，对其进行多种癌基因的甲基化检测，可以绘制出该肿瘤的甲基化谱[23-24] 。近年来，国内外学者通过不同肿瘤中相关基因甲基化异常的特点分析，目前已确定了许多以DNA 甲基化为基础的潜在生物标志物并进行了肿瘤早期诊断的临床研究[25] 。如GSTPI 基因甲基化异常频发于前列腺癌中，但并不发生在良性增生的前列腺組织中，多个研究显示尿液中GSTPI 基因甲基化检测可准确的用于前列腺癌筛查[26-27] 。Belinsky 等[28] 检测了吸烟者和肺癌患者痰液中的DAPK、P16、MGMT等基因，发现3 个以上基因甲基化阳性肺癌患者吸烟者是不吸烟者的6. 2 倍。进一步设计病例对照研究发现，基因甲基化随着肺癌诊断的时间接近而增加， 以DAPK、P16、MGMT、 RASSF1A、GATA 等6 个基因作为评价指标，其中3 个以上基因甲基化阳性肺癌风险增加6. 5 倍，筛查肺癌的敏感性和特异性达到65%[29] 。

2 DNA 甲基化与电离辐射的关系

近年来，世界上一些研究机构也在用各种分子生物学技术研究放射作业人群的健康效应，试图从分子水平揭示辐射损伤机制。其中表观遗传修饰是研究热点，电离辐射诱导的癌症受MAPK、NF-κB、Wnt、mircroRNA 等相关信号分子的影响，表明表观遗传在辐射致癌机理中发挥关键作用[30] 。

DNA 甲基化是表观遗传学的一种重要形式，电离辐射诱导DNA 甲基化研究正在不断深入。国际放射防护委员会（ICRP）103 号报告指出，电离辐射存在基于表观遗传的远后效应，尤其是DNA 甲基化的改变[31] 。研究表明，电离辐射诱导的DNA 甲基化改变与辐射暴露剂量、类型和持续时间相关[32] ，并且具有明显的组织特异性和剂量特异性[33] 。

电离辐射导致机体全基因组DNA 低甲基化，DNA 低甲基化状态可引起碱基错配未完全修复，从而导致染色体畸变率增加。Lee 等[34] 对核电厂工作人员（年有效剂量为53 mSv）职业辐射暴露诱导DNA 甲基化改变的队列分析提示，低剂量电离辐射职业暴露也可能造成机体DNA 甲基化的改变，全基因组甲基化水平与辐射剂量呈负相关。DNA 甲基化水平与工人染色体畸变相关，认为职业接触低剂量辐射会影响DNA 甲基化水平，辐射诱导的DNA 甲基化改变可能与染色体畸变有关。Kuzmina 对前苏联切尔诺贝利核电厂清理工人的体内DNA 甲基化进行分析，受照组为切尔诺贝利83 名核电厂清理工人（ 累积剂量范围： 30 ～480 mSv）和21 名其他核工人（ 累积剂量范围：11～994 mSv），对照组为208 名为未受照人员。通过p16/ INK4A、p14/ ARF、RASSF1A 和GSTP1 啟动子甲基化水平研究发现，p16/ INK4A 和GSTP1基因的甲基化水平显著高于对照组，且与辐射暴露相关，不受其他因素影响[35] 。

3 DNA 甲基化在钚辐射致癌机制中的研究

DNA 甲基化在肿瘤的发生发展中起重要作用，全体基因组的低甲基化、癌基因调控区的低甲基化和抑癌基因调控区的高甲基化与癌症的发生和进展相关。钚辐射导致的基因组不稳定性是其致癌的机制之一，而基因组的DNA 甲基化与基因组不稳定性相关，因此DNA 甲基化模式改变导致基因组不稳定性进而导致钚辐射致癌的机制具有重要意义[36-37] 。

流行病学研究结果提示，Mayak 工人患肺腺癌的风险明显高于对照组，并且与钚暴露有很高的相关性[38] 。美国Lovelace 呼吸研究所与俄罗斯SUBI 联合进行了一项关于Mayak 核工业工人肺癌分子标志物的研究。

2004 年，该研究组收集了71 例Mayak 核工厂钚接触工人及69 例非受照组工人（对照组），两组均为肺腺癌患者，工人暴露于钚的吸收剂量和γ外照射剂量的中位数分别为520 mGy 和1 330mGy。对71 名Mayak 肺腺癌工人的DNA 甲基化分析，肺的累积剂量在1 ～ 15 cGy 时，发生一个基因甲基化占35%，两个以上基因甲基化36%;累积剂量在16 ～ 137 cGy 时，发生一个基因甲基化占35%，两个以上基因甲基化50%。根据统计分层分析结果发现，钚暴露与p16 甲基化间存在着明显的剂量反应关系;钚内照射暴露最高的工作人员，其肺腺癌中p16 甲基化的风险比对照组增加3. 5 倍[39] 。

2007 年，对66 名受照工人和63 名非受照工人（对照组） 的腺癌进行了GATA - 5、PAX5β 和H-cadherin 基因甲基化检测。结果显示，至少有一个基因发生甲基化;受照工人肺腺癌中甲基化率93%，而对照组中甲基化率为66%;与对照组相比，Mayak 工人肿瘤中GATA-5 甲基化率显著增加。基因启动子高度甲基化导致基因失活的频率增加和肿瘤抑制基因（如GATA-5）的靶向性可能是与辐射暴露相关的肺癌风险增加的主要因素[40] 。另外，对396 名既往受照工人（钚接触者且无癌症人群） 的痰基因（ p16、MGMT、DAPK、RASSF1a、PAX5α、PAX5β、GATA-4 和GATA-5）的甲基化进行检测与分析。结果发现与Lovelace队列相比，Mayak 工人痰中甲基化超过4 个的工人数量显著增加。

Kuzmina 等[41] 通过研究49 名Mayak 工人外周血白细胞的某些基因的甲基化水平，研究其年龄和辐射暴露对某些基因高甲基化的影响。受照组（年龄为67～84 岁）γ 外照射的累积剂量959 ～4 095 mGy，钚的累积剂量0 ～ 21. 8 mGy;同时选取50 名与年龄匹配的非接触者，研究细胞周期调控基因（ RASSF1A、p16/ INK4A、p14/ ARF、TP53、ATM）、抗氧化防御（SOD3）基因的甲基化频率等。结果显示，暴露组8 个基因中至少一个基因的启动子甲基化率（71. 4%） 显著高于对照组（40%）。与对照组相比，受照组个体GSTP1、TP53、SOD3 启动子中CpG 岛甲基化的频率显著升高，与年龄相关的RASSF1A 和p14/ ARF 基因甲基化可能与辐射暴露有关。

除人群流行病学研究外，国内外部分学者在细胞水平进行了关于DNA 甲基化在α 粒子导致的辐射损伤机制研究。研究认为辐射诱发细胞恶性转化影响了DNA -PKs（ 参与DNA 修复） 的活性，该蛋白在非同源重组和转录调控中起重要作用[42-43] 。而目前认为DNA 甲基化异常是正常转录调控缺失的一种机制[44] 。

Yamada 等[45] 利用预先建立的二氧化钚吸入导致的鼠肺癌细胞模型分析p16 甲基化情况。结果显示，在鼠肺上皮细胞恶性转化的早期即出现p16启动子区甲基化现象，使p16 基因失活，p16基因表达的缺失可能在钚导致的肺癌发生发展中起重要作用。

军事医学科学院隋建丽等[46-47] 研究了α 粒子照射细胞传代培养不同时期部分DNA 修复基因结构或表达变化，发现受照细胞在恶性转化早期（5～20 代），DNA 修复基因ATM、DNA-PKcs 的表达就受到抑制，XRCC-5 基因发生了碱基突变，部分DNA 修复基因如MGMT 和细胞周期G2 -M调控基因发生甲基化导致表达抑制。

4 小结

通过Mayak 队列研究钚致肺癌与DNA 甲基化的相关性结果提示，钚致肺癌的进展过程中涉及了多种基因异常甲基化，这些基因甲基化异常可能在钚的辐射损伤过程中发挥了重要作用。体外的细胞实验结果也提示，特定基因在α 辐射损伤早期由于发生甲基化导致表达抑制。上述研究结果均提示DNA 甲基化在钚辐射损伤机制中起着重要的调控作用，那么在α 粒子导致DNA 双链断裂过程中，DNA 甲基化如何发挥作用？ 需要进一步探索研究。