华蟾素对大鼠腹腔肠粘连影响机制的实验研究

张好生 单连梅 孙汝萌 宫红彦 王永 李强 金晓

[关键词]华蟾素；腹腔肠粘连；大鼠；转化生长因子-β1；肿瘤坏死因子-α

肠粘连是外科手术后的一种常见并发症，常导致肠梗阻，严重危害患者的健康。其机制与组织缺血、损伤以及异物刺激引发的局部过度炎症反应有关，急性炎症期渗出物如果不能充分溶解、吸收，成纤维母细胞便会产生胶原，胶原沉积导致腹腔内永久性粘连[1-2]，肿瘤坏死因子、转化生长因子、白介素等细胞因子在其中可能起重要的调节作用[3]，临床上尚无理想的药物预防肠粘连。华蟾素注射液是我国自行研制的，由中华大蟾蜍皮制成的水制剂，性质稳定，具有清热解毒、利尿消肿、化结溃坚作用，临床常用于抗肿瘤的治疗[4]。华蟾素能抑制血管通透性，减少炎性渗出[5]，在治疗胸腹水方面取得了一定的疗效[6]，华蟾素还可以保护胃肠道黏膜屏障，减缓黏膜的损伤，也可以抑制腹泻和结肠炎等不良反应[7-8]，据此推测，华蟾素的抗炎作用可能同样适用于腹腔内损伤，在术后防治肠粘连方面可能发挥一定的作用，经文献检索未发现该方面的报道。

本实验观察华蟾素腹腔灌注对术后腹腔粘连的影响，现总结报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 40只雄性SD大鼠，SPF级，体重220～250g，6周龄，济南朋悦实验动物有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（鲁）2014-0007。饲养期间给予大鼠无菌饲料饮用水。本实验经动物实验伦理委員会批准通过，批件编号：烟山伦准2022048号。

1.1.2 实验药品及试剂 华蟾素注射液（安徽华润金瞻药业股份有限公司，国药准字Z34020274）；透明质酸钠凝胶MSHG（上海建华精细生物制品有限公司，批号：18033012，规格：10mg/ml）；转化生长因子-β1（transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1）和肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）酶联免疫吸附试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

1.1.3 实验仪器 主要仪器：AU480全自动生化分析仪（美国Beckman公司）；HeraeusMultifugeXIR离心机（美国赛默飞）。

1.2 实验方法1.2.1 动物分组 40只大鼠随机分为4组：假手术组（开关腹组）、对照组（肠粘连模型对照组）、透明质酸钠组、华蟾素组，每组各10只。

1.2.2 制备肠粘连模型 大鼠适应性饲养1周，禁食不禁水12h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，神志消失后将大鼠仰卧固定于解剖盘内，碘伏消毒胸腹部皮肤。下腹部正中长2cm直切口进腹，提出切口外确认盲肠后，假手术组关腹。其余三组Ellis法制备大鼠肠粘连模型[9]，提出盲肠，盐水纱布均匀摩擦浆膜面，损伤区域约1cm×2cm，摩擦至出现微小出血点为止，滴一滴无水乙醇于创面加重损伤，然后用血管夹夹闭盲肠系膜动脉2min，造成局部缺血再灌注损伤。盲肠相对的腹壁上用手术刀刮出1cm×1cm大小的区域损伤面，滴一滴无水乙醇加重损伤。然后用3-0VCP772D可吸收线将盲肠与腹壁损伤面缝合一针固定，防止盲肠游移，确保粘连形成。关闭腹腔，分笼饲养（20℃～25℃）8d，正常饮食饮水。造模过程中无大鼠死亡。

1.2.3 给药 关闭腹腔后，假手术组和对照组5ml注射器腹腔内注入生理盐水5ml/kg[1]，连续3d腹腔注射同剂量的生理盐水。透明质酸钠组和华蟾素组关闭腹腔后腹腔内分别注入5ml/kg透明质酸钠和5ml/kg华蟾素[10]。

1.3 指标检测及评价标准

1.3.1 观察腹腔内粘连形成情况 颈椎脱臼法处死大鼠，腹部“U”形切开，观察腹腔内状况。Nair[11]5级分类法进行粘连程度分级评分，即腹腔内完全无粘连为0级；内脏间或内脏与腹壁间一条粘连带为Ⅰ级；二条粘连带为Ⅱ级；多于二条粘连带，而内脏未直接粘连到腹壁为Ⅲ级；内脏直接粘连到腹壁，不管粘连带多少均为Ⅳ级。

1.3.2 静脉血TNF-α浓度和腹水TGF-β1浓度检测 眼眶取血0.5ml，收集腹水0.2ml，分别于-80℃低温保存，酶联免疫吸附剂测定法（ELISA）检测静脉血TNF-α浓度和腹水TGF-β1浓度。

1.3.3 病理学检测 取盲肠组织及其对侧5mm×5mm腹膜和粘连组织，10%多聚甲醛固定。使用梯度乙醇脱水后，常规石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察炎症细胞浸润情况。粘连纤维带组织常规石蜡包埋、切片，Masson三色染色，光镜下观察纤维组织增生情况。

1.4 统计学方法

采用SPSS22.0软件进行统计学分析。粘连程度分级采用完全随机设计的秩和检验，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 华蟾素对大鼠肠粘连的大体观察

假手术组伤口周围无粘连或有微小粘连，粘连等级在0～Ⅰ级，以0级为主；对照组均发生粘连，且粘连带多于两条，少部分分离出血，粘连等级在Ⅲ～Ⅳ级，以Ⅲ级为主；透明质酸钠组粘连以1～2条粘连带为主，等级以Ⅰ级为主，少部分为Ⅱ级；华蟾素组粘连数量少且不紧密，很容易分离，等级以Ⅰ级为主，部分为0级。华蟾素组与对照组比较，粘连明显减轻，华蟾素组明显优于对照组。华蟾素组与透明质酸钠组比较，平均秩略微好一点，粘连减轻，但差异无统计学意义（P>0.05）。见图1和表1～2。

2.2 TGF-β1和TNF-α浓度比较

对照组与假手术组比较，TGF-β1及TNF-α显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）；透明质酸钠组与假手术组比较，TGF-β1及TNF-α升高，差异有统计学意义（P<0.05）；华蟾素组与假手术组比较，差异无统计学意义（P>0.05），华蟾素组与对照组比较，TGF-α1及TNF-α显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），与透明质酸钠组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.3 粘连组织中炎症程度和粘连程度的比较

光镜下炎症程度比较：假手术组炎症损伤轻，光镜下可见盲肠和腹膜间见少量炎症细胞浸润或无炎症细胞浸润；对照组粘连组织中可见纤维组织增生、大量急慢性炎症细胞浸润，部分呈弥漫性炎症，可出现退行性变伴坏死；透明质酸钠组和华蟾素组可见少量纤维组织增生和部分变性，间质中可见中等量炎症细胞浸润，局灶见多核巨细胞反应。华蟾素组与透明质酸钠组镜下表现炎细胞和纤维组织增生分布区别不明显。见图2。

光镜下粘连程度比较：假手术组可见到间质细胞间很薄的一层纤维组织，纤维组织间见薄薄的间皮细胞；对照组盲肠腹壁间粘连带中可见纤维组织增生增厚，间皮细胞增生，炎细胞浸润明显；透明质酸钠组与华蟾素组可见部分粘连组织中少量纤维增生和间皮细胞增生，炎细胞浸润轻微。透明质酸钠组与华蟾素组纤维组织和间皮细胞增生较假手术组增生明顯活跃，比对照组增生略轻。见图3。

3 讨论

肠粘连的发生机制目前倾向损伤、炎症学说。损伤、感染等造成炎症细胞、间皮细胞、内皮细胞等释放炎症介质，造成毛细血管扩张，通透性增高，浆液渗出。刺激释放凝血活酶，促使纤维蛋白原转化为纤维蛋白。这些渗出液在术后3h即凝结形成粘连，3d内即自行溶解。若粘连能保持3d或更久而不被吸收，则有成纤维细胞及新生毛细血管长入，形成永久粘连[2，12]。

本实验发现，与假手术组相比，对照组腹腔内粘连程度比较重，提示肠粘连模型是成功的；与对照组相比，华蟾素组和透明质酸钠组均能明显降低组织间粘连，提示华蟾素和透明质酸钠组在减轻肠粘连方面是有效的，但与假手术组相比腹腔粘连仍较重，二者达不到假手术组的效果，提示其防粘连作用有局限性。华蟾素组与透明质酸钠组相比，华蟾素组平均秩略好，但二者相比差异无统计学意义。

光镜下检查发现，华蟾素组和透明质酸钠组中炎性细胞浸润程度和纤维增生程度均较对照组轻，表明华蟾素可减轻急性炎症反应，这与文献[7-8]的研究结果是一致的，再次证实华蟾素具有抑制炎症反应的作用。华蟾素可通过抑制急性炎症期的炎症反应，减少炎性渗出，从而抑制纤维组织增生和纤维化形成[13-14]，达到减轻大鼠腹腔内粘连的状况。

本实验还观察到，华蟾素可显著降低腹腔内TGF-β1含量和血清中TNF-α含量，这与文献报道是一致的[13，15]，进一步表明，TGF-β1和TNF-α等炎症介质可能发挥了较为重要的作用[3]。

由此，本实验结果进一步支持了炎症损伤学说，提示手术损伤造成炎症细胞浸润，释放TGF-β1和TNF-α等炎症介质，使毛细血管扩张，通透性增高，浆液渗出。华蟾素通过抑制炎细胞移出、减少损伤组织中炎细胞浸润程度，从而抑制TGF-β1和TNF-α等炎症介质的释放，最终减少胶原纤维蛋白原转化为胶原纤维蛋白，抑制纤维组织增生，从而达到减轻肠粘连程度的目的。

本实验还观察到华蟾素组与透明质酸钠组相比，TGF-β1和TNF-α炎症介质水平差异无统计学意义，腹腔内粘连分级差异虽无统计学意义，但平均秩明显要好一点，提示华蟾素在预防腹腔肠粘连上比透明质酸钠可能有一定的优势。分析粘连分级无统计学意义的原因可能是样本量较少，TGF-β1和TNF-α差异无统计学意义可能与大鼠损伤已度过急性炎症阶段，而取材时间已趋向平缓有关，需要在以后的实验中进一步验证。另外，华蟾素属于水溶性制剂，临床腹腔冲洗和灌洗等均比透明质酸钠等药物方便，临床上更容易开展使用。

综上，华蟾素腹腔灌注可以抑制急性炎症期的炎症细胞反应和抑制纤维组织增生，从而减轻腹腔肠粘连程度，其机制可能与抑制TGF-β1和TNF-α的过度表达有关。华蟾素属于水溶性制剂，临床上更容易开展使用。