荧光示踪前哨淋巴结的研究进展

史宛瑞，崔立刚，梁晓龙

前哨淋巴结（sentinel lymph node，SLN）作为原位肿瘤发生淋巴结转移的第一站，对于决定肿瘤分期、治疗以及预后意义重大，因此对 SLN 示踪尤为重要。SLN 示踪技术是指采用各种示踪剂显示肿瘤引流区域淋巴结。目前主要分为三种方法：核素探测法、染料法和荧光探测法。其中，临床上使用的放射性胶体和染料介导的 SLN 示踪方法有其局限性。采用放射性胶体进行淋巴结定位的缺点主要有以下几方面：医护人员的辐射暴露、辐射物的处理问题、高昂的医疗成本以及对获取放射性同位素的限制等[1]。采用染料法对 SLN 进行示踪主要包括以下几种染料：亚甲蓝、纳米碳、异硫蓝和专利蓝等，染料法显示肿瘤引流区域淋巴结也有其局限性，如全身过敏反应、高假阴性率、致密脂肪组织中的低显示率以及 SLN 中的积聚和停留时间不足等[2-3]。相比之下，在提高转移性淋巴结的检测灵敏度方面，荧光探测法在淋巴结定位中的应用具有巨大的前景。传统的荧光探针有吲哚菁绿、亚甲蓝等染料，它们能够灵敏地显示 SLN，但仍然存在一些问题，如染料自身颜色会污染手术视野，在淋巴结累积较少、停留时间短等，均会影响示踪效果。因此，具有多功能的荧光纳米探针相继被开发用于克服传统荧光探针的缺点[4]。

对于荧光成像，优良的荧光染料分子的筛选需要考虑以下标准：荧光波长、量子产率、溶解度、光稳定性、清除率和毒性等。在荧光波长方面，吸收和散射是阻碍荧光在组织中传播的限制因素[5]。随着荧光波长的增加，光的吸收和散射可以最小化[6]。荧光量子产率是检验荧光探针效率的另一个标准[7]。到目前为止，大多数报道的荧光探针在血清中的量子产率为 10%～20%，更高的量子产率非常罕见[8]，为开发具有改进的量子产率和光稳定性的新荧光探针留下了很大的空间。荧光探针需要较好的可溶性，以便进入淋巴系统。荧光探针应具有较低的光化学破坏性和较高稳定性，从而有利于其实际应用。荧光探针的潜在毒性是阻碍其临床转化的首要因素，应仔细考虑毒性问题，包括其化学成分、稳定性以及参数，以便进行临床前研究和临床应用[9]。近年来，国内外学者对 SLN 影像示踪进行了深入的研究，开发出各种新型荧光探针用于淋巴结示踪。本文就 SLN 荧光示踪方法的研究进展予以综述，为未来开发更有前景的示踪方法奠定基础。

1 吲哚菁绿

吲哚菁绿是一种近红外三碳菁染料，具有较好的生物安全性，已广泛应用于癌症诊断和其他领域，包括眼科的血管造影术、心输出量和肝功能的评估、组织和器官的灌注分析、光动力治疗和光热治疗等[10]。除了上述应用外，吲哚菁绿在 SLN 中的应用也很有前景。

吲哚菁绿作为肿瘤的荧光示踪剂有许多优点，包括其对原发病灶的定位、对 SLN 活检的引导，为外科手术提供了重要的术中信息[11]。与传统的淋巴结病理检查相比，吲哚菁绿示踪 SLN 可以有效减少淋巴结切除术后的并发症。几项临床试验和临床前研究表明，吲哚菁绿在检测癌症 SLN 方面优于蓝色染料和放射性胶体[12-13]。Kitai 等[14]在一项 18 例癌症患者的初步研究中发现，SLN 可通过皮下注射吲哚菁绿进行鉴定，检测率约为 94%。这种方法使外科医生能够识别具有低侵袭性的 SLN，为检测癌症患者的腋窝 SLN提供了一种简单而快速的方法。Papathemelis 等[15]在 104 名癌症患者中对示踪剂吲哚菁绿和 Technetium99m显示 SLN的敏感性进行了临床评估，吲哚菁绿和 Technetium99m对SLN 的检测率分别为 98% 和 100%。该研究强调了吲哚菁绿与 Technetium99m相比的优势，因为其成本低，并避免了有害辐射。

然而，由于亲水性差，与其他荧光染料相比检测灵敏度欠佳等原因，吲哚菁绿的应用也有一定的局限性[16]。此外，吲哚菁绿由于其分子量低，很容易扩散到位于真正转移淋巴结附近的其他淋巴结[16]。因此，非转移性淋巴结可能被错误诊断为转移性淋巴结，导致癌症分期错误。

2 亚甲蓝

亚甲蓝作为荧光染料对 SLN 进行定位，具有操作简单、价格便宜、无需使用其他设备的优势，是目前临床上应用较为广泛的示踪剂。最初使用高剂量亚甲蓝静脉注射，用于识别甲状旁腺肿大，并导致腺体呈蓝色[17]。Yue 等[18]的研究中，亚甲蓝对腋窝逆向淋巴结示踪的成功率可高达93.5%。然而，使用高剂量亚甲蓝有许多缺点。亚甲蓝引起皮肤和尿液明显变色，可能会导致患者出现过敏反应[19]。此外，其神经毒性可能会在一定程度上导致发病。一些研究利用了亚甲蓝的近红外特性，它可以实现比可见光更好的组织穿透。亚甲蓝是最常用于淋巴结定位的染料之一，具有80% 的总检测率和 50% 的双侧淋巴结检测率[20-22]。与吲哚菁绿相比，亚甲蓝因其不与蛋白结合的固有特性，其荧光在组织中具有更好的穿透能力[23]。因此，亚甲蓝比吲哚菁绿更适合对 SLN 进行示踪，因为它具有更高的吸收率和更少的荧光污染[23]。但是亚甲蓝染色特异性差，量子产率弱，需要的定位时间较长，而且染色时间较短，不利于作为示踪剂对 SLN 进行精准定位。因此，需要对材料进行改进以获得效果满意的示踪剂。

3 荧光纳米探针

荧光示踪剂吲哚菁绿和亚甲蓝已应用于淋巴结定位，但是它们在淋巴结内的积聚效果差、由于分子量低易于扩散到真正转移淋巴结外的其他淋巴结等，这些可能会影响 SLN定位的准确性[24]。克服这些缺点的潜在方法是将这些示踪剂标记于纳米颗粒上，以提高其稳定性和循环时间，从而促进它们在肿瘤中的积聚。纳米技术和材料化学方面正在进行的研究工作促进了基于纳米材料的新型荧光探针的开发，这大大加快了荧光成像在 SLN 定位中的应用[25]。纳米材料具有独特的物理化学性质，如纳米尺寸、高稳定性和显著的表面积/体积比，这使它们对 SLN 定位更有前景[26]。

研究表明，将传统示踪剂特别是吲哚菁绿嵌入纳米材料中，可以增强荧光染料在肿瘤的积聚、生物相容性和特异性。与单独的游离染料相比，可以以更低的剂量产生更高的荧光信号[27]。纳米探针的表面性质与其稳定性、毒性和生物分布密切相关[28]。例如，有研究利用氨基修饰的聚乙二醇或胺修饰的右旋糖酐结合氧化石墨烯上的羧基，使纳米材料在各种生理溶液中具有良好的稳定性[29]；因 DNA 具有特异性杂交的结构，将其组装到纳米探针上，可通过新型光热溶解策略减轻纳米探针的长期毒性作用[30]；而在纳米颗粒外包被特定的涂层，如两性离子化合物等，可以最小化生物分子冠的作用，改变纳米颗粒的生物分布[31]。靶向纳米探针的最新进展证明了表面功能化对 SLN 定位更具特异性和选择性[32]。最近的一些研究表明，使用靶配体如多肽、抗体和受体配体来修饰于纳米探针的表面，即可通过特异性靶向转移性肿瘤细胞来实现对 SLN 的示踪[33-34]。例如，Chen等[35]设计并制备了一种负载脑内皮细胞靶向剂血管肽-2 和抗肿瘤药物（线粒体靶向剂三苯基膦修饰的氯尼达明）的趋化性纳米马达，实现了对脑内皮细胞-肿瘤细胞-线粒体的精确分步靶向。以下重点介绍几种近期基础研究中研发的荧光纳米探针。

3.1 IR780 和甘露糖共轭体组装的纳米颗粒

转移淋巴结的特异性识别是临床研究的重点和难点，尤其是前哨淋巴结是否发生转移，对于决定手术术式和治疗计划至关重要，传统的荧光探针难以满足要求。为了达到特异识别就需要解决靶向和背景荧光干扰问题。在实际应用中往往需要根据病变区域微环境的特点来设计探针。例如，当癌症出现恶性倾向时，集落刺激因子-1 和趋化因子-2 从周围环境中吸收单核细胞，分化为 M2 肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages，TAM），增加肿瘤细胞的侵袭，进一步促进肿瘤的发展，在转移性淋巴结中发现了大量的 M2 TAM[36]。据此，Zhao 等[37]将甘露糖通过二硫键与近红外（near infrared，NIR）染料 IR780 连接，得到甘露糖-IR780 缀合物（MR780），该缀合物进一步自组装成对谷胱甘肽响应的近红外纳米荧光探针。在生理条件下，该探针具有较好的稳定性并且保持荧光猝灭状态。而在转移性淋巴结中，MR780 纳米探针表面的甘露糖作为一种简单的天然配体，可以选择性地与 TAM 表面 CD206（macrophage mannose receptor，MMR）结合，进一步在肿瘤微环境中谷胱甘肽作用下断开二硫键，纳米探针发生解体进而恢复荧光。该纳米荧光探针提供了一种通过靶向 M2 TAM 的新方法来检测小鼠乳腺癌症早期淋巴结转移，可以实现精准靶向和无创成像双重功能。

3.2 吲哚菁绿标记的铁蛋白纳米颗粒

传统的纳米颗粒成像很难提供任何关于特定肿瘤的淋巴结或淋巴管中参与的信息。这种非特异性示踪可能导致精确度降低，也会导致材料扩散到非转移性淋巴结，这对转移淋巴结的准确定位有很大影响。靶向受体配体识别可以很好地解决这些问题。吲哚菁绿标记的纳米颗粒在实时淋巴结定位和局部区域淋巴结示踪的效果已在许多研究中得到证实[13]，而将其与具有靶向特性的蛋白颗粒结合则有望进一步提高其示踪能力。研究表明，乳腺癌细胞中 H 铁蛋白和TfR1 之间具有较强的靶向亲和力，将吲哚菁绿标记到 H铁蛋白片段上表现出优异的特性。这项研究表明，给药 6 h后，肿瘤中有强烈的吲哚菁绿负载的 H 铁蛋白信号，而游离吲哚菁绿没有表现出肿瘤靶向特异性。因此，吲哚菁绿标记的铁蛋白纳米颗粒可能表现出良好的荧光特性，细胞摄取能力和高肿瘤靶向能力增加[38]。

3.3 脂质体荧光纳米颗粒

脂质体也具有巨大的治疗潜力，它们几乎可以包裹任何的小分子。脂质体的生物相容性好，颗粒的尺寸可以从几纳米到几微米不等，其物理和化学性质已经被充分研究，是用于药物递送和治疗的良好载体[39]。荧光材料可以共价或非共价结合到脂质体上（在脂质膜上或在内水腔中）。此外，它们的表面可以很容易地用生物识别分子进行功能化，如抗体、聚糖和多肽等，用于特异性靶向。例如，叶绿素在结构上与卟啉相似，都具有近红外荧光特性，是一种安全的荧光材料，在生物体内成像具有很大潜力。但是叶绿素水溶性差，为提高其水溶性进行 SLN 成像，可将其封装到纳米脂质体中。Fan 等[40]通过使用叶绿素结合的脂质体进行了淋巴结定位。他们发现，平均尺寸为 22 nm 的脂质体能够在小鼠模型中发射大约 680 nm 的荧光，用于 SLN 定位。此外，他们观察到该材料对巨噬细胞和正常肝细胞系的细胞毒性较低，在临床 SLN 定位上具有巨大潜力。

3.4 基于荧光硅纳米颗粒的外泌体探针

为了克服传统纳米示踪剂的一些固有缺点，如纳米材料粒径和形状难以控制，影响其性质；尺寸小、活性高，容易被环境中杂质所污染等，可以通过对其表面进行修饰或者优化制备条件，从而得到更加稳定、性质更好的材料。外泌体作为参与细胞间通讯的特异性膜泡，近年来受到了极大的关注。与合成的纳米颗粒相比，外泌体具有免疫原性低、毒性低等优点。此外，外泌体还有很强的同源靶向能力，因此肿瘤来源的外泌体有望在肿瘤治疗中发挥重要作用。荧光硅基纳米材料具有相对强的荧光、优异的稳定性、毒性低等特点，适用于长期实时的生物成像。基于以上材料特性，Han 等[41]开发了基于硅纳米颗粒的外泌体（SiNPs@EXO），可以很好地区分转移性淋巴结和正常淋巴结，该研究也证明了癌细胞来源的外泌体具有靶向同源细胞的能力。因此，具有稳定荧光特性的 SiNPs 和具有肿瘤归巢效应的癌细胞来源的外泌体的联合为转移性淋巴结的示踪提供了一种新方法。SiNPs@EXO 的荧光信号在注射后 15 min 达到峰值，甚至在注射后 3 h 仍保持相对较强的强度，表明该类探针可以快速准确地检测转移淋巴结。

3.5 荧光双靶向纳米颗粒

除了可用于多种癌症的传统纳米颗粒外，有些研究还设计了特定于某种肿瘤的纳米颗粒。为了提高靶向特异性，单一靶向有时不能满足定位需求，需要设计双靶向纳米颗粒进行示踪。如使用负载 NIR 荧光染料 DiR-BOA 的双靶向纳米颗粒来靶向淋巴结中的乳腺癌细胞，通过使用两种成像方式（荧光成像和光声成像）实现对淋巴结的识别[42-43]。其中，乳腺癌过表达 CD44 受体，通过透明质酸靶向 CD44 作为该纳米颗粒的第一个靶点[44]。然而，CD44 的表达位点容易受到透明质酸占用的影响，很容易饱和，导致肿瘤靶向性不佳[45]。双受体靶向给药系统将更有效地靶向乳腺癌细胞，因此，开发了一种类似肽-磷脂支架纳米颗粒的高密度脂蛋白，可以靶向乳腺癌的另一受体-B 类 I 型清道夫受体（scavenger receptor class B type I，SR-BI）。值得注意的是，该纳米颗粒可以通过荧光成像或光声成像快速实现淋巴结可视化，同时具有 CD44 和 SR-BI 的双重靶向性[46]。

4 多模态成像探针

在临床实践中，除了荧光成像外，CT、PET、MRI 和放射性同位素成像通常也是 SLN 定位的检查方法[47]。然而，每种成像方式都有其独特的优势和固有的局限性，例如放射性同位素成像提供了良好的穿透深度，也可以定量检测，但是分辨率较差，不能清楚地识别淋巴结。MRI 在软组织（如淋巴系统）中对比度高，可以提供功能信息，但是灵敏度有限、空间分辨率低[48-49]。类似地，PET/CT 的空间和时间分辨率也较差[47]。荧光成像提供了高空间分辨率和时间分辨率，但是由于渗透深度有限，淋巴通路的成像受到影响[50]。因此，结合荧光成像和其他成像方法的多模态纳米探针的设计有利于更好地进行 SLN 的示踪[47]。为此，Huang 等[51]将正电子发射放射性核素64Cu、NIR 染料ZW800 和 MRI 造影剂 Gd3+三者整合到介孔SiNP 中，以促进 4T1 荷瘤模型中 SLN 的多模态（NIRF/MRI/PET）成像。这种三模态的纳米探针在转移性 SLN 的定位中有其独特的优势，在摄取率、稳定性和滞留时间上都有所提升。然而，需要进一步的研究，以优化三种成像粒子的比例、颗粒大小和临床转化的递送途径。

5 结论与展望

淋巴结定位对判断恶性肿瘤预后有重要意义。SLN 示踪可早期识别区域淋巴结中的微转移，有助于恶性肿瘤患者采取合适的治疗方式，显著改善患者的预后。然而，传统的SLN 示踪剂（如小分子染料）有一定的局限性。近年来，专门用于 SLN 定位的非侵入性分子成像方法得到了快速发展，如荧光成像，因其具有高灵敏度和非放射性[36]。纳米技术发展迅速，为寻找更合适的荧光探针用于无创 SLN成像奠定了良好的基础，其优势包括优异的光学稳定性、尺寸可调、更高的荧光强度和丰富的表面功能化修饰等。尽管纳米荧光探针在准确定位淋巴结方面取得了显著进展，但仍存在一些局限性，如纳米探针的临床转化受到材料毒性的影响。在设计纳米探针时，不仅要注意它们的性能，还要注意长期的生物安全性，这对临床转化至关重要；一些纳米探针仅能用于特定肿瘤的示踪，不适合在其他肿瘤中应用。因此，在纳米颗粒设计时应更多地关注不同肿瘤之间的差异和联系，以不同肿瘤之间的相似性为切入点；此外，大多数纳米探针用于 SLN 定位，不适用于多发淋巴结转移的患者。因此，在纳米颗粒的设计中应更多地注意适用于所有转移淋巴结。相信随着纳米技术的飞速发展，荧光探针在 SLN 的示踪中将得到进一步的发展，甚至可以结合治疗功能，其前景值得期待。